實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)肉制品中的鴨源性成分

摘 要：通過鴨的肌動(dòng)蛋白β-actin保守基因設(shè)計(jì)可特異檢測(cè)鴨肉成分的引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測(cè)鴨肉的方法，并通過模擬肉樣和市售樣品檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和適用性。結(jié)果表明：該方法可以特異性檢測(cè)出麻鴨和草鴨成分，而對(duì)豬、牛、羊、雞等DNA均沒有擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1 pg DNA;通過模擬肉樣檢測(cè)確定最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)限為0.01%;市售樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法能很好地應(yīng)用于市場(chǎng)，滿足市場(chǎng)檢測(cè)需求。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);鴨肉;靈敏度;檢測(cè)限

Detection of Duck-Derived Ingredients in Meat Products by Real-time Fluorescent Polymerase Chain Reaction

ZHANG Xiuping1， MIAO Li2，*

（1.Identification Consulting Center of Henan Inspection and Quarantine， Zhengzhou 450003， China;

2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Zhengzhou 450003， China）

Abstract： According to the conserved sequence of the duck β-actin gene， specific primers and probes were designed， and a real-time polymerase chain reaction （PCR） assay was developed for detecting duck-derived ingredients in meat products. Its accuracy and applicability were evaluated using model and commercial meat samples. Results showed that this method could specifically detect duck-derived ingredients and could not amplify porcine， bovine， ovine and chicken DNA. Its limit of detection was 1 pg of DNA. The minimum detectable level was 0.01% for model meat samples. The results obtained from detection of commercial meat samples showed that this method can meet the requirements for the requirements for the detection of duck-derived components in meat products.

Keywords： real-time fluorescent polymerase chain reaction; duck; sensitivity; detection limit

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807007

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）07-0037-05

引文格式：

食品的質(zhì)量和安全問題日益成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，隨著人們生活水平的提高，肉制品消費(fèi)已經(jīng)成為食品消費(fèi)的重要組成[1-3]，而目前利用摻雜摻假、以次充好等手段制造“假羊肉”、“假牛肉”事件屢屢出現(xiàn)[4]。檢驗(yàn)檢疫部門有必要加強(qiáng)對(duì)于肉及肉制品的檢測(cè)，以確保國(guó)內(nèi)消費(fèi)者的權(quán)益得到保護(hù)。

在食品中動(dòng)物源性成分鑒定方面，實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)憑借其高度靈敏性和特異性，已逐步成為肉類成分鑒別的重要技術(shù)[5-7]。楊麗霞等[8]根據(jù)鴨線粒體基因序列的位點(diǎn)差異設(shè)計(jì)特異性引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，通過溶解曲線分析，建立熒光定量PCR檢測(cè)方法。史艷宇等[9]以鴨線粒體基因全序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，建立鴨源性成分檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1 μg/kg。

β-actin基因是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，具有基因序列高保守性，并且在不同組織間可以穩(wěn)定表達(dá)[10-12]。當(dāng)前研究中多選用線粒體基因，線粒體DNA由于豐度高且在不同組織部位的含量不一致，容易導(dǎo)致定量結(jié)果偏差較大，而β-actin基因作為單拷貝基因，具有基因序列高保守性，在肉源性成分定性及定量方面具有重要參考價(jià)值。

本研究通過從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找序列并設(shè)計(jì)鴨特異的PCR引物和探針，建立快速、準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)方法，為食品市場(chǎng)檢測(cè)構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉以及鴨肉制品

鄭州市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);蛋白酶K（20 mg/mL） 日本TaKaRa公司;Tris-飽和酚、氯仿-異戊醇（24∶1） 北京

索萊寶生物科技有限公司;組織裂解液（1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS））、75%無水乙醇 自配;所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 7500熒光定量PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;DT500電子天平 江蘇常熟長(zhǎng)青儀器廠;Hermle Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)哈默公司;NTS-4000AM恒溫振蕩水槽 上海斯信有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用酚-氯仿法提取樣品的基因組DNA，具體步驟參考文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行，最后加入100 μL TE緩沖液溶解DNA，然后采用核酸定量測(cè)定儀測(cè)定提取肉樣的DNA含量。

1.3.2 引物和探針設(shè)計(jì)

通過核酸比對(duì)軟件DnamaN對(duì)GenBank中公布的多個(gè)物種的β-actin基因共17 個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)，其中包括5 個(gè)鴨源β-actin基因（GenBank中的登錄號(hào)分別為EF667345.1、NM_001310421.1、GU564232.1、AY251275.1和DQ675572.1）、3 個(gè)雞源β-actin基因（GenBank中的登錄號(hào)分別為L(zhǎng)08165.1、NM_205518.1和JF436880.1）、3 個(gè)豬源β-actin基因（GenBank中的登錄號(hào)分別為DQ452569.1、DQ845171.1和U07786.1）、3 個(gè)羊源β-actin基因（GenBank中的登錄號(hào)分別為NM_001009784.1、U39357.1和AF035422.1）、2 個(gè)牛源β-actin基因（GenBank中的登錄號(hào)分別為AY141970.1和BT030480.1）和1 個(gè)鵝源β-actin基因（GenBank中的登錄號(hào)為M26111.1），篩選出鴨β-actin基因的特異序列，并運(yùn)用Primer 5.0軟件（加拿大Premier開發(fā)公司）設(shè)計(jì)鴨源性成分的特異性引物和探針。引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物和探針序列如表1所示。

1.3.3 熒光PCR反應(yīng)程序

反應(yīng)體系為25 μL：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL（反應(yīng)體系終濃度0.2 μmol/L）、探針1 μL（反應(yīng)體系終濃度

0.4 μmol/L）、DNA模板2 μL，其余用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，58 ℃、45 s;40 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 引物與探針的特異性驗(yàn)證

以從豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉中提取的DNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證所設(shè)計(jì)各引物和探針體系的特異性。

1.3.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

提取純鴨肉粉DNA，調(diào)整DNA模板的初始質(zhì)量濃度為100 ng/μL，用滅菌雙蒸水分別進(jìn)行10 倍倍比稀釋，然后分別取2 μL各稀釋度的稀釋液為模板，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測(cè)所設(shè)計(jì)引物、探針的靈敏度。

1.3.6 檢測(cè)下限的確定

取總質(zhì)量為10 g的肉粉，在雞肉基質(zhì)中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的鴨肉粉，用研磨機(jī)進(jìn)行混樣，得到梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鴨肉粉樣品;稱取100 mg樣品進(jìn)行DNA提取和熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定檢測(cè)下限。

1.3.7 市售樣品的檢測(cè)

為驗(yàn)證該方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中的可應(yīng)用性，購(gòu)買市售的10 個(gè)生產(chǎn)廠家的鴨肉加工制品，運(yùn)用本方法進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)運(yùn)用SN/T 3731.5—2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分 鴨成分檢測(cè) PCR法》[15]中的方法進(jìn)行驗(yàn)證，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Excel軟件進(jìn)行圖表編輯，采用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（United Nations Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）方法規(guī)定統(tǒng)一的檢測(cè)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）≤25%。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與濃度測(cè)定

提取DNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.7～2.0之間，完全符合實(shí)時(shí)熒光PCR的要求。

2.2 特異性測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，麻鴨和草鴨的DNA均有擴(kuò)增，而豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉等其他物種的DNA均沒有擴(kuò)增，表明鴨的引物和探針特異性良好，可以用于熒光PCR檢測(cè)。

2.3 靈敏度測(cè)定結(jié)果

分別利用麻鴨和草鴨的5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的DNA稀釋液（0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 ng/?L）為模板，對(duì)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)和可重復(fù)性分析。

由表2～3可知：當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.000 1 ng/?L時(shí)，在20 次擴(kuò)增反應(yīng)中，麻鴨和草鴨陽性擴(kuò)增次數(shù)分別為4 次和9 次，不滿足檢出率≥95%（即20 次擴(kuò)增，陽性結(jié)果≥19 次）;當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.000 5 ng/?L時(shí)，在20 次擴(kuò)增反應(yīng)中，所有鴨樣本均得到20 次陽性結(jié)果，滿足檢出率≥95%，且RSD≤25%，故鴨樣品可穩(wěn)定檢出的最低質(zhì)量濃度均為0.000 5 ng/?L，即最低DNA質(zhì)量濃度為1 pg DNA（模板量2 ?L）。

2.4 方法檢測(cè)限

由圖2和表4可知：當(dāng)雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%時(shí)，3 次平行測(cè)定中均能夠檢出鴨源性成分，平均Ct值34.97;而當(dāng)雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%時(shí)，平均Ct值38.18，數(shù)值較高，不利于判定，因此本方法檢測(cè)雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢出限為0.01%。

2.5 市售樣品的檢測(cè)

由圖3可知，6 份標(biāo)識(shí)有鴨成分的加工品中能夠檢出鴨源性的為5 份，其中1 份未檢出麻鴨和草鴨成分，與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果一致，表明市面上可能存在假冒的鴨肉產(chǎn)品。

3 討 論

動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量安全涉及畜牧業(yè)的健康發(fā)展，其安全和質(zhì)量越來越受到公眾的關(guān)注，而傳統(tǒng)的依靠感官和經(jīng)驗(yàn)鑒別的手段已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)需求，建立準(zhǔn)確、快速、有效的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法是研究熱點(diǎn)[16-18]。

基于PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)飼料和肉制品中的動(dòng)物源性成分已得到了較多關(guān)注和研究[19-20]。何瑋玲等[21]運(yùn)用動(dòng)物細(xì)胞色素b（cytochrome b，cytb）基因的差異性位點(diǎn)，建立了豬、牛、羊和雞的快速鑒別方法;陳冬等[22]運(yùn)用牛線粒體12S rRNA基因設(shè)計(jì)通用引物，成功鑒別混合鮮牛肉及制品中的牛種來源，但是對(duì)于鴨源成分的檢測(cè)研究不多。曲莉等[23]采用改良鹽析法和柱層析法有效提取鴨肉的mtDNA，通過在GenBank中下載綠頭鴨線粒體cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)檢測(cè)鴨源成分的引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為223 bp。SN/T 3731.5—2013以及楊滴等[24]的研究主要應(yīng)用普通PCR技術(shù)對(duì)鴨源性成分進(jìn)行檢測(cè)，普通PCR技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，容易污染，逐步被熒光定量PCR方法取代[25-27]。因此，迫切需要建立新的鴨源性成分檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)，以滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。

動(dòng)物特異性基因具有物種特異性，有望成為肉類成分定性檢測(cè)的良好靶點(diǎn)[28-30]。本研究根據(jù)羊、牛、豬、雞、鵝5 種動(dòng)物肌動(dòng)蛋白β-actin基因序列的位點(diǎn)差異設(shè)計(jì)鴨特異性引物和探針，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果表明，所篩選的引物和探針只對(duì)鴨的DNA產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線，而與豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉10 種動(dòng)物的DNA無擴(kuò)增，特異性較好。通過對(duì)DNA梯度稀釋液進(jìn)行測(cè)定顯示，該方法的重復(fù)性好，靈敏度可低至1 pg，避免了因提取過程中DNA含量過低而出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。而在實(shí)際檢測(cè)中，肉制品中鴨源成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)更能接近市場(chǎng)需求，因此，本研究通過制作模擬肉樣，確定了最低檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為我國(guó)肉制品市場(chǎng)的規(guī)范化和有序化管理提供了必要的技術(shù)支撐，對(duì)政府部門的監(jiān)督管理工作具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究利用鴨的β-actin基因保守序列，建立用于檢測(cè)鴨成分的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。經(jīng)測(cè)試，建立的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，方法檢測(cè)限為1 pg DNA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%，且具有良好的可重復(fù)性，能夠滿足日常檢測(cè)的需求。對(duì)于市售樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，5 份標(biāo)注含鴨成分的實(shí)際樣本中均能檢出鴨成分，有1 份包裝鹵鴨肉產(chǎn)品未檢出鴨成分，表明產(chǎn)品可能存在摻假現(xiàn)象。

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