CT引導下肺穿刺活檢標本行PCR檢測診斷肺結核的臨床價值

郭俊紅 武春燕 董正偉 吳偉 張莉萍 李輝 黃焰

結核病是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，據2017年世界衛生組織發布的全球結核病年度報告顯示，全球每年有超過1000萬例新發結核病患者，同時有近170萬例患者死于結核病[1]。受到疾病臨床分期、抗生素大量使用等多種因素影響，痰涂片抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養等的檢測陽性率較低，結核病診斷困難。近年來，采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術檢測結核分枝桿菌成為診斷結核病的有效手段[2]，而肺細針穿刺細胞學(fine needle aspiration cytology，FNAC)病理檢測因其簡單快捷、微創安全而被廣泛應用于臨床取樣，可幫助診斷肺部疾病[3-4]。目前兩者聯合檢測的研究較多，但主要集中在對肺外結核的診斷[5-7]，對肺結核診斷效能的研究還較少。本研究采用 CT引導下肺細針穿刺活檢標本行TB-PCR檢測，以探討兩者聯合在肺結核診斷中的應用價值。

材料和方法

一、 研究對象

1.一般資料：回顧性選取2017年1月至2018年3月同濟大學附屬上海市肺科醫院曾疑診為肺結核、后經病理證實或試驗性抗結核藥物治療確診的111例患者，其中肺結核患者73例(65.8%)，非肺結核患者38例(34.2%；包括結節病3例、肺癌17例、隱球菌感染3例、曲菌感染4例、肺膿腫3例、異物肉芽腫2例，支氣管擴張癥6例)。111例患者均在CT引導下獲取肺穿刺活檢標本行涂片細胞病理學檢查(簡稱“細胞病理學檢查”)，其中13例因兩次細胞病理學檢查不能確診而行CT引導下粗針肺穿刺活檢標本組織病理學檢查(簡稱“組織病理學檢查”)；上述標本均同時采用PCR檢測結核分枝桿菌DNA(分別簡稱為“細胞病理學標本TB-PCR檢測”與“組織病理學標本TB-PCR檢測”)。

111例患者中，男71例(64.0%)，女40例(36.0%)；年齡16～79歲，平均(49.9±17.8)歲；臨床表現為反復咳嗽、咳痰，伴或不伴消瘦、盜汗、胸痛、胸腔積液等癥狀。73例(65.8%)肺結核患者中，男48例(65.8%)，女25例(34.2%)；年齡16～79歲，平均(45.2±19.0)歲。以臨床最終診斷為標準，探究細胞病理學標本TB-PCR檢測診斷肺結核的檢測效能(敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、正確指數)，以及組織病理學標本TB-PCR檢測的檢出效用。

2.診斷標準：(1)肺結核：根據新版《WS 288—2017肺結核診斷標準》[8]入組，包括①臨床診斷肺結核：依據患者的結核病病史、臨床表現、胸部影像學及實驗室相關檢查、肺外組織病理及診斷性抗結核治療效果診斷；②確診患者：依據痰涂片、痰培養、分子生物學、組織病理學檢查診斷。(2)非結核肺部疾病：對結核病相關檢查陰性或存在懷疑體征時，通過再次穿刺、組織學、細胞學檢查，根據病理學及臨床檢測明確診斷的其他疾病，如肺癌、結節病、真菌感染等。

3.病理診斷：對首次細胞病理診斷可疑者再次行細胞病理學檢查，若兩次均不能確診則穿刺或手術后取組織樣本行組織病理學檢查。

二、穿刺細胞病理學檢查及細胞病理學標本TB-PCR檢測

1.穿刺及細胞學制片：由臨床醫生行CT引導下經皮肺穿刺，于CT定位點處常規消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，持22 G×0.7 mm穿刺針穿刺，立即涂片1張投入95%乙醇固定15 min后采用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)。針管內剩余材料打入液基瓶保存。充分振蕩混勻細胞，去除血凝塊、組織碎塊后，放入離心機890×g離心10 min，棄上清留取沉淀，加入30 ml 液基細胞保存液(CytoRichTM)紅色固定液，振蕩后靜置30 min，890×g離心10 min，倒掉上清并充分振蕩，吸取1～5滴轉移至12 ml離心管內，加入10 ml緩沖液，890×g離心5 min，倒上清并振蕩，在玻片架上與離心管對應的位置上放SurePathTMPreCoat玻片，將吸液管與對應的試劑瓶正確連接，運行制片程序。

2.鏡下表現：根據Bezabih等[9]的研究分型：(1)增殖型：可見類上皮細胞，包括郎罕細胞及組織細胞、淋巴細胞(增殖性肉芽腫)。(2)干酪樣壞死型：可見壞死組織伴或不伴有炎癥背景。(3)混合型：干酪樣壞死型伴有增殖型。

3.判定標準：細胞病理學檢查診斷結核病的主要依據是切片中找到干酪樣壞死物、郎罕細胞和類上皮細胞，若三者同時見于細胞學切片可診斷結核病，若只出現1種或2種則為可疑結核病[10]。

4. 細胞病理學標本TB-PCR檢測：(1)DNA的提?。簩⒓毎±韺W標本離心，棄上清留取沉淀，具體操作步驟嚴格按照核酸提取DNA說明書(廈門艾德生物有限公司)進行。(2)Stratagene Mx 3000P型熒光定量PCR儀擴增：按照結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書(北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司)進行。

三、組織病理學檢查與組織病理學標本TB-PCR 檢測

1.組織病理學檢查：由臨床醫生行CT引導下經皮肺穿刺，于CT定位點處常規消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，持18 G×1.2 mm活檢穿刺針穿刺。將穿刺標本放入10%甲醛固定液內送病理檢查，經脫水、包埋、切片及HE染色制片。

2.病理診斷：組織病理學診斷結核病的依據：特征性病理學形態特點(壞死性肉芽腫性病變)及抗酸染色結果陽性。

3. 組織病理學標本TB-PCR檢測：將組織病理學標本進一步切成蠟卷，脫蠟后進行DNA提取，所有操作、儀器、制劑的使用均同細胞病理學標本TB-PCR 檢測。

四、統計學處理

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。使用敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致性評價細胞病理學標本TB-PCR檢測診斷肺結核的檢測效能。相關公式：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；正確指數(或一致性)=敏感度+特異度-1。

結 果

一、細胞病理學標本TB-PCR檢測效能

細胞病理學標本TB-PCR檢測對肺結核的檢測敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、正確指數分別為83.6%(61/73)、89.5%(34/38)、93.8%(61/65)、73.9%(34/46)、0.73；單一細胞病理學檢查肺結核的檢測敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、正確指數分別為39.7%(29/73)、94.7%(36/38)、93.5%(29/31)、45.0%(36/80)、0.34，見表1。前者對肺結核檢測的陽性率(83.6%)明顯高于后者(39.7%)，差異有統計學意義(χ2=29.663，P=0.000)。

二、細胞病理學標本與組織病理學標本行TB-PCR 檢測結果的比較

13例肺結核患者組織病理學標本行TB-PCR檢測，陽性者8例；而細胞病理學標本行TB-PCR檢測陽性者為12例。另外，73例肺結核患者中有9例經穿刺活檢細胞病理學、組織病理學檢查均未能診斷出肺結核，同時傳統結核分枝桿菌培養及熒光抗酸染色檢查等亦均陰性，細胞病理學標本行TB-PCR檢測后有4例為陽性。此外，本研究有4例患者細胞病理學標本行TB-PCR 檢測陽性，經再次穿刺細胞病理學檢查診斷為小細胞癌1例、腺癌2例；經組織病理學檢查診斷肺曲菌球病1例。

三、肺結核不同細胞學分型患者行TB-PCR檢測結果分析

臨床最終診斷為肺結核的73例患者中，鏡下表現為增殖型9例，細胞病理學標本TB-PCR檢測陽性3例(3/9)；干酪樣壞死型35例，細胞病理學標本TB-PCR檢測陽性32例(32/35)；混合型29例，細胞病理學標本TB-PCR檢測陽性26例(26/29)。

討 論

肺結核至今仍然是嚴重威脅全球人民健康的呼吸道傳染性疾病，近年來結核病患者例數呈上升趨勢[1,11-12]，但受患者疾病臨床分期、抗生素大量使用等多種因素影響，細菌學培養陽性率較低，且診斷周期為4～6周，很難滿足為患者及時制定治療方案的臨床需求[13]。在臨床實踐中發現，結核病與諾卡菌感染在細胞病理學檢查中形態學都可見多核巨細胞及壞死，且諾卡菌抗酸染色亦可呈陽性，但諾卡菌對長周期抗生素治療有效，因此準確的診斷是至關重要的，需要進行分子病理檢測或培養加以鑒別[14]。為提高我國肺結核診斷水平，國家衛生和計劃生育委員會[8]重新發布了新版《WS 288—2017肺結核診斷》，在細菌學檢查的基礎上，新增了分子生物學檢查，強調可以以病原學、病理學結果作為確診依據。

表1 以臨床診斷為標準評價細胞病理學標本TB-PCR檢測與細胞病理學檢查的效能

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；正確指數(或一致性)=敏感度+特異度-1

細胞病理學檢查具有易于操作、技術安全、診斷迅速、準確率高等優點[15]，我院開展細胞病理學檢查10余年，有豐富的細胞病理學診斷經驗，如采用細胞病理學檢查有明確相關疾病(包括惡性腫瘤、結核病、結節病、其他良性疾病等)的病理學診斷，臨床可以根據該結果(陽性)為確診依據制定治療方案；若細胞病理學檢查不能明確(陰性)診斷，如未見惡性病變依據或只見肉芽腫病變無法區分結核病、結節病、真菌感染等，則同期進行經皮肺穿刺、縱隔鏡、胸腔鏡及開胸取活檢組織病理學檢測為最終診斷依據[15]。細胞學病理標本TB-PCR檢測有著較高的敏感度(56%)、特異度(100%)[16]，可將結核分枝桿菌染色體特異的極微量的DNA擴增百倍以上。本研究對肺結核細胞病理學標本TB-PCR檢測的陽性率[83.6%(61/73)]明顯高于單一細胞病理學檢測肺結核的陽性率[39.7%(29/73)]，差異有統計學意義(χ2=29.663，P=0.000)。提示在細胞病理學檢查的基礎上增加TB-PCR檢測可提高肺結核檢測的陽性率，病理學檢查醫生在顯微鏡下發現可疑結核病證據后，立即行細胞病理學標本TB-PCR 檢測，可極大地縮短診斷時間，為臨床治療提供方便。

細胞病理學標本TB-PCR檢測可能使部分結核病患者在組織學活檢和病原學均陰性的情況下減少進一步的組織學檢查[16]。本研究對13例肺結核患者組織病理學標本行TB-PCR檢測，陽性者8例；而細胞病理學標本行TB-PCR檢測陽性者為12例，高于前者。表明細胞病理學標本行TB-PCR檢測的陽性檢出例數優于前者，有利于降低臨床穿刺風險及減少術后并發癥。但是由于樣本量小，檢驗結果可能存在偏倚，今后需進一步收集更多樣本加以驗證。此外，本次研究肺結核患者中有9例經穿刺活檢組織病理學檢查未獲得診斷依據，同時傳統技術(痰涂片抗酸染色及痰培養)檢測結果亦陰性，其中4例經細胞病理學標本TB-PCR檢測呈陽性，進一步提示細胞病理學標本TB-PCR檢測可減少進一步的組織病理學檢查。

結核病常見的組織病理學改變為壞死性肉芽腫性炎，但亦可為非壞死性肉芽腫性炎，亦可見缺少肉芽腫病變的干酪樣壞死結節，典型的結核結節中心為干酪樣壞死，周邊可見類上皮細胞和(或)郎罕細胞，外周有纖維結締組織和慢性炎細胞浸潤。本研究鏡下細胞病理學與組織病理學形態相符，病變內可見類上皮細胞、干酪樣壞死及郎罕細胞[17]。本研究根據細胞學形態分為增殖型、混合型及干酪樣壞死型[9]。本研究73例肺結核患者中，細胞病理學標本TB-PCR檢測出陽性患者干酪樣壞死型(32例，32/35)及混合型(26例，26/29)的比例高于增殖型(3例，3/9)，可能與增殖期荷菌量少、毒力低，而此時人體免疫力還較強，結核分枝桿菌在結核結節形成過程中被及時清除有關。本研究仍有12例患者細胞病理學標本TB-PCR檢測陰性，可能與部分患者(7例)正在或既往進行過抗結核藥物治療有關；導致病灶標本中結核分枝桿菌菌量少而難以檢出，另外，穿刺活檢組織位于壞死中心或穿刺時引起出血等均可明顯干擾結核分枝桿菌DNA的提取。

研究表明，肺結核并發肺癌的發生率為0.22%～2.7%，并且呈逐年增加的趨勢[18]，抗結核和抗腫瘤雙重治療可改善患者預后[19-20]。對于肺癌并發肺結核的患者，兩病具有相似的臨床癥狀和影像學特征，易被誤診、漏診而影響治療時機[21]。曲球菌常寄生于許多肺部病變構成的空洞或空腔中，如肺結核空洞、慢性肺膿腫、肺癌等[22]，也常為肺結核的并發疾病。本研究有4例細胞學病理標本TB-PCR檢測陽性，經再次穿刺細胞病理學檢查診斷為小細胞癌1例、腺癌2例；經組織病理學檢查診斷曲菌球1例。因穿刺活檢標本行細胞學檢查及組織學檢查時穿刺部位較局限，不能排除存在肺結核并發肺癌、曲菌球感染的情況，但在可能存在并發疾病的情況下及時發現及治療肺結核非常必要，細胞病理學標本及組織病理學標本行TB-PCR檢測可簡便、快速地幫助診斷肺結核。

綜上所述，細胞病理學標本TB-PCR檢測是診斷肺結核的有效手段，在細胞病理學檢查的基礎上增加細胞病理學標本TB-PCR檢測可提高肺結核檢測的陽性率，在肺結核的病理診斷中具有良好的應用價值。