分子病理學診斷頸部淋巴結結核及其耐藥性的應用價值

穆晶 劉子臣 宋婧 李琨 車南穎 劉紅剛

淋巴結結核(tuberculosis lymphadenitis，TBLN)是最常見的肺外結核，占肺外結核的30%～40%，其中以頸部淋巴結結核最為多見，占淋巴系統結核的80%～90%[1-3]。在耐多藥結核病高負擔國家中，快速診斷頸部淋巴結結核及其耐藥性，對頸部淋巴結結核的早期診斷和早期治療，以及對結核病疫情的控制均具有重要意義。

病理學診斷是確診結核病的重要手段，尤其在痰菌陰性肺結核和肺外結核的診斷中發揮著重要作用。傳統病理學檢查主要通過組織形態學觀察到肉芽腫病變伴或不伴壞死，以及抗酸染色查找抗酸桿菌診斷結核病。近年來，基于核酸擴增技術的分子病理學方法，應用于石蠟包埋組織(formalin fixed paraffin-embedded，FFPE)，通過檢測結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)特異基因序列確診結核病。作為傳統病理學檢查的補充，分子病理學方法明顯提高了MTB的陽性檢出率，并可通過檢測MTB耐藥相關基因的突變情況，篩選可能的耐藥結核病患者。

目前常用的分子病理學方法有熒光定量PCR技術、利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“GeneXpert”)、探針熔解曲線技術等，其中探針熔解曲線技術具有快速、敏感度和特異度高等特點，在結核病耐藥性檢測中得到廣泛應用。在結核病患者的臨床分離菌株和FFPE 標本的利福平和異煙肼耐藥性檢測中，探針熔解曲線技術檢測結果與表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的檢測結果均具有較高的一致性[4-5]。筆者以熒光定量聚合酶鏈式反應(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)和探針熔解曲線方法檢測頸部淋巴結結核FFPE標本的MTB-DNA和利福平、異煙肼耐藥相關基因，以評估分子病理學診斷頸部淋巴結結核及其耐藥性的臨床應用價值。

資料和方法

一、材料

1. 研究對象：搜集2010年3月至2013年10月首都醫科大學附屬北京胸科醫院病理科病理組織形態為慢性肉芽腫性炎伴或不伴壞死(圖1)、符合納入標準的全部頸部淋巴結FFPE標本97份(例)，作為結核組；其中男34例(35.1%)，女63例(64.9%)，年齡15～70歲，平均年齡(32.01±1.22)歲。選取同期符合納入標準的全部其他淋巴結病變20份(例)，作為非結核組，包括結節病6例，淋巴瘤6例，壞死性淋巴結炎3例，巨大淋巴結增生癥(Castleman病)3例，淋巴結反應性增生2例。其中男11例(55.0%)，女9例(45.0%)，年齡20～70歲，平均年齡(43.85±3.77)歲。

2. 納入標準：結核組患者納入標準為病理形態學符合結核病病理變化特征，臨床癥狀和體征符合頸部淋巴結結核，抗結核藥物治療好轉證實為淋巴結結核，以臨床最后診斷為標準；其他淋巴結病變患者納入標準為通過病理學或臨床檢測結果明確診斷為其他淋巴結疾病。

二、實驗方法

1. 標本處理：所有淋巴結標本均經4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察組織學形態。

圖1 頸部淋巴結結核病理形態學顯示病變組織呈慢性肉芽腫性改變(HE ×200)圖2 Z-N 抗酸染色后觀察到紅色桿狀、略彎曲、串珠狀抗酸桿菌(油鏡 ×1000)

2. 抗酸染色法：所有117例患者的標本采用萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色法查找抗酸桿菌，染色試劑盒(BA-4090B)購自珠海貝索生物技術有限公司。石蠟組織切片厚4 μm，以常規二甲苯脫蠟，以梯度乙醇脫水(高濃度到低濃度)后入水；經石碳酸復紅染色1 h，水洗后鹽酸乙醇分化數秒至無紅色，再進行水洗；采用亞甲藍溶液染色20 s，水洗；以梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，采用中性膠封片，應用油鏡( ×1000)進行觀察。結果判定：觀察到紅色桿狀、略彎曲、串珠狀抗酸桿菌為抗酸染色陽性(圖2)。

3. FQ-PCR方法：所有117例患者以FQ-PCR技術檢測MTB-DNA。FFPE標本的DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取按照試劑盒操作手冊進行。MTB核酸測定試劑盒(熒光PCR法)購自中山大學達安基因股份有限公司，檢測MTB特異基因序列IS6110。實時熒光定量PCR儀為羅氏Cobas Z 480全自動熒光定量PCR分析儀。按照試劑盒說明書進行操作，出現典型S形擴增曲線為陽性。

4. 分枝桿菌培養：52例結核組患者頸部淋巴結病灶清除組織、膿液同時送檢MTB培養，其中改良羅氏法23例，BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體培養法29例。改良羅氏法：接種后的改良羅氏培養基置于37 ℃培養，每周檢查一次細菌的生長狀態直至有菌落生長為止。以MTB標準株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照。MGIT 960液體培養法：取2 ml膿液標本用于培養，嚴格按照MGIT 960系統操作說明書進行，培養時間設定為42 d。儀器報告陽性后，取培養液進行涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

5. 探針熔解曲線檢測耐藥基因突變：對41例FQ-PCR檢查結果為陽性且MTB-DNA含量能夠

滿足耐藥突變檢測下限的患者進行探針熔解曲線法檢測利福平、異煙肼耐藥突變情況。MTB利福平耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法；廈門致善生物科技股份有限公司)檢測rpoB基因利福平耐藥決定區507～533共27個氨基酸密碼子(81 bp)的突變；MTB異煙肼耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法；廈門致善生物科技股份有限公司)檢測ahpC啟動子區(-44～-30、-15～3位點)、inhA94 密碼子、inhA啟動子區(-17～-8位點)、katG315密碼子突變。按照試劑盒說明書操作。熔解曲線的熔點(Tm值)低于陽性對照2 ℃及以上判定為突變。

三、統計學處理

利用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、抗酸染色法與FQ-PCR技術的敏感度和特異度

97份(例)頸部淋巴結結核FFPE標本中抗酸染色查到抗酸桿菌22份(例)，敏感度為22.7%；FQ-PCR技術檢測MTB-DNA陽性65份(例)，敏感度為67.0%，FQ-PCR技術檢測陽性率明顯高于抗酸染色法，差異有統計學意義(χ2=38.53，P<0.001)。非結核組標本抗酸染色法與FQ-PCR法檢測結果均為陰性，兩者特異度均為100.0%。見表1。

二、分枝桿菌培養結果

52例結核組患者行病灶清除術的同時送檢頸部淋巴結病灶組織、膿液進行MTB培養，其中改良羅氏法23例， MGIT 960液體培養法29例，結果均未見分枝桿菌生長。

表1 抗酸染色法與FQ-PCR技術檢測結果分析

注均以臨床最后診斷為標準；敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%，特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%，陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%，陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%，符合率=(真陽性例數+真陰性例數)/(真陽性例數+假陽性例數+假陰性例數+真陰性例數)×100%

表2 探針熔解曲線法檢測14例利福平和(或)異煙肼耐藥情況

注a：無法評估；b：未行分枝桿菌培養

三、探針熔解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥突變情況

對41例FQ-PCR檢查結果為陽性且MTB-DNA含量滿足耐藥突變檢測下限的患者標本進行耐藥突變檢測，利福平和異煙肼可評估標本分別為10份(例)和27份(例)，其中利福平耐藥1份(例)，異煙肼耐藥13份(例)。見表2。

討 論

一、傳統淋巴結結核病理學診斷及細菌學診斷的局限性

傳統病理學診斷結核病主要依靠組織形態學觀察和抗酸染色查找抗酸桿菌，然而形態學改變并不特異，抗酸染色由于FFPE組織中荷菌量較少，單靠肉眼直接觀察易出現遺漏，存在敏感度和特異度低、費時費力等不足[6-7]。劉燕翔等[8]對144例頸部肉芽腫樣病變的病理組織采用抗酸染色法查找抗酸桿菌，陽性檢出率為4.86%。車南穎等[9]的研究中，淋巴結結核抗酸染色陽性率為27.5%。淋巴結細針穿刺或從破潰部位取膿液行抗酸桿菌涂片檢查和MTB培養仍作為常規檢查手段應用于臨床，并以病變中培養出分枝桿菌作為診斷的“金標準”。Purohit 等[10]的研究發現，細針穿刺涂片和膿液培養的陽性率分別為11.7%和23.1%。劉燕翔等[8]的研究中，頸部肉芽腫病變的細菌培養法陽性檢出率為18.75%。肺外結核標本的分枝桿菌培養存在陽性率低、培養時間長，不能滿足臨床早期、快速診治的需要[11-12]，所以迫切需要能夠快速檢測結核分枝桿菌復合群(Mycobateriumtuberculosiscomplex，MTBC)及其耐藥性的新方法和新工具。

二、分子病理學診斷結核病

結核病的病理學確診需要分子病理學檢查作為重要的輔助手段，通過檢測MTB特異基因如IS6110、16srDNA、Mpt64等可以明顯提高結核病的陽性診斷率。國內外多項研究及本科室的前期研究均證實基于核酸擴增技術的分子生物學檢測方法在FFPE組織中檢測MTBC，明顯提高了敏感度，縮短了診斷時間，且在多種組織FFPE標本中有良好的應用價值，為結核病的診斷和鑒別診斷提供了可靠依據，大大提高了結核病診斷的準確性[13-18]。由于分子病理學檢查方法具有較高的敏感度和特異度，2017年《中國結核病病理學診斷專家共識》將其作為結核病病理學診斷的金標準[19]。實時熒光定量PCR技術是目前臨床應用最為廣泛的分子病理檢測技術，其主要優勢在于操作簡便、成本低廉、快速敏感等。本研究結核組97份(例)標本中，抗酸染色查到抗酸桿菌22份(例)，敏感度為22.7%；FQ-PCR 技術檢測MTB-DNA陽性65份(例)，敏感度為67.0%；FQ-PCR技術檢測敏感度明顯高于抗酸染色法，差異有統計學意義。非結核組兩種方法檢測結果均為陰性，特異度均為100.0%。

三、分子病理學診斷耐藥結核病

MTB的耐藥基因突變是產生耐藥結核病的最主要原因，利用分子病理技術檢測組織標本中的MTB是否發生耐藥基因突變是病理學診斷耐藥結核病的重要手段。如通過檢測rpoB基因突變可以檢測利福平耐藥MTB，通過檢測katG、inhA、ahpC等基因突變可以檢測異煙肼耐藥MTB。

常用的技術有實時熒光定量PCR技術和探針雜交技術，其中最具代表性的技術是GeneXpert檢測系統。Xpert技術以rpoB基因為靶基因，同時檢測MTB和利福平耐藥。Polepole等[20]評估了GeneXpert技術用FFPE標本診斷肺外結核和利福平耐藥的準確性。研究共納入100例臨床懷疑結核病的FFPE標本(包括淋巴結病變64例，男性生殖道病變10例，腹部病變8例，女性生殖系統病變5例，乳腺組織病變5例，滑膜組織病變4例，皮膚病變2例，舌部病變1例，甲狀腺病變1例)，進行GeneXpert和PCR技術檢測MTB特異基因序列IS6110，同時進行Z-N抗酸染色，以組織病理學診斷作為金標準。結果顯示，在淋巴結組織中，GeneXpert檢測準確率為41%，稍稍優于Z-N抗酸染色或PCR檢測；在非淋巴結組織中，PCR檢測的敏感度為82%，明顯高于GeneXpert檢測(P=0.004)。此外，GeneXpert方法檢測到3例利福平耐藥，14例利福平耐藥“不確定”。García-Basteiro等[21]對30例尸檢的肺組織標本進行MTB篩查，以real-time PCR和環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測方法確認MTB-DNA的存在，依據微生物學和組織病理學結果診斷結核病；以GeneXpert方法對診斷出的8例肺結核標本進行檢測，發現其中有7例陽性、1例陰性，陰性患者的PCR和LAMP檢測結果均為陽性，界定為GeneXpert假陰性；GeneXpert技術在肺組織的檢測敏感度為87.5%，特異度為95.7%，GeneXpert與PCR 和LAMP方法對肺組織的檢測一致率為93.6%，對腦組織和肝組織則均為100.0%；未檢測到利福平耐藥。Che等[5]對82例臨床疑似結核病的淋巴結病變同時進行細菌培養、GeneXpert及熔解曲線FFPE 標本檢測，結果顯示熔解曲線FFPE標本檢測利福平耐藥與GeneXpert檢測結果完全吻合。這些研究都初步驗證了分子病理學方法檢測FFPE標本診斷結核病及其耐藥性的可行性。

實時熒光定量PCR方法與探針熔解曲線分析方法相結合也可以應用于耐藥基因的檢測。目前應用比較多的探針雜交技術有膜反向雜交法和基因芯片法等。這些技術都可以實現一次實驗中檢測多種抗結核藥物的耐藥相關基因突變。本研究以探針熔解曲線方法檢測41份(例)PCR陽性頸部淋巴結結核FFPE標本的利福平和異煙肼耐藥基因突變情況，結果顯示利福平耐藥1份(例)，異煙肼耐藥13份(例)。與Zhao等[22]報道的我國利福平單耐藥情況較為一致。本研究中，52例患者病灶清除術同時送檢頸部淋巴結病灶組織、膿液進行MTB培養(改良羅氏培養法或MGIT 960液體培養法)，結果均未見分枝桿菌生長，更無法進一步進行藥敏試驗獲得藥敏結果。因此，分子病理技術檢測FFPE標本MTB及其耐藥性，可以在一定程度上彌補傳統細菌學診斷陽性率低的不足。

四、分子病理學診斷耐藥結核病的局限性及改良措施

本研究中利福平耐藥可評估標本僅為10份(例)，可評估率為24.4%(10/41)，異煙肼可評估標本27份(例)，可評估率為65.9%(27/41)。分析可評估率較低的原因可能與以下因素有關：(1)FFPE標本荷菌量少。受組織標本消化前處理效果影響，對于較大組織，4 μm厚度切取8～10片即達極限，而活檢組織標本本身所含病變成分較少，可能獲取的菌體數量就更加有限。另外，FFPE樣本提取得到的DNA，大部分是人類基因組DNA，只有少部分是菌類DNA，可能對擴增效率產生一定抑制。FFPE 樣本提取的DNA也存在一定的碎片化，且存儲時間越長，碎片化或降解越嚴重。這些原因使得FFPE標本提取到的有效DNA有限。(2)試劑敏感度對DNA含量要求較高，FFPE標本提取的DNA中MTB-DNA含量需要達到耐藥試劑所需求的MTB-DNA檢測底限。應用中發現，單純MTB-DNA檢測底限為500～1000 拷貝/ml，而利福平耐藥需要的檢測下限為20 000拷貝/ml，異煙肼耐藥需要的檢測下限為10 000拷貝/ml。所以，在MTB-DNA陽性樣本中，會遇到耐藥試劑無法評估的樣本。

對于如何最大限度地挖掘FFPE樣本MTB-DNA和耐藥檢測的檢測效率，筆者分析可以通過以下途徑：首先，用于提取DNA的蠟塊應由病理醫師核對HE切片后確定，選取形態學改變典型、病變成分多、易于富集菌的組織樣本進行檢測；其次，建議選取2年內的FFPE標本進行檢測，避免由于儲存時間過長、DNA降解造成的假陰性結果；此外，對于拷貝數小于耐藥試劑檢測下限50%以內的樣本，可以嘗試將DNA適當濃縮之后再進行耐藥檢測。

五、本研究的不足之處

筆者在本文的撰寫過程中查詢了所有患者的病灶組織、膿液培養結果，初衷是要與組織標本的分子病理結果作比較分析，以評估分子病理學檢測MTB及其耐藥性的敏感度和準確性。實際查詢過程中發現所有進行MTB培養的患者培養結果均為“分枝桿菌未生長”。查詢病歷發現多數患者是在外院進行了穿刺涂片或活檢后考慮結核病，并且經過了抗結核藥物治療，這些因素導致了在我院沒有進行細菌學診斷或是細菌難以生長(有文獻報道抗結核藥物治療影響培養結果[5])。因此，沒有培養及藥敏試驗的結果來驗證分子病理學檢測耐藥的準確性。本研究探索了分子病理學診斷頸部淋巴結結核的敏感度及檢測頸部淋巴結結核耐藥性的可行性，然而，有關FFPE標本耐藥檢測的敏感度和準確性還有待更多的研究來評估。

綜上所述，分子病理學診斷技術可作為FFPE標本檢測MTB的有效手段，提升頸部淋巴結結核的病原學陽性率，并可篩選耐藥結核病患者，為臨床開展精準治療提供重要依據。