豬冷凍精液技術(shù)的應(yīng)用實踐與探索研究

周先前，張全生，余群蓮

（重慶農(nóng)投肉食品有限公司，重慶 401120）

1 豬冷凍精液應(yīng)用的意義

我國多年來主要依賴于國外引種，活體引種帶來多種疾病和成本的提高等諸多問題，隨著我國種豬聯(lián)合育種和地方品種培育工作的深入開展，豬的冷凍精液技術(shù)研究越來越顯得迫切，對豬冷凍精液的研究發(fā)展也很快，各地很多豬場都在探索應(yīng)用。由于凍精可以使優(yōu)良基因得到長期的保存，延長公豬使用年限，而不受該公豬死亡、損失、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為地使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，獲得更大的遺傳進(jìn)展。引進(jìn)國內(nèi)外高性能公豬凍精取代活體公豬的引進(jìn)，使種豬選擇擴大到較大范圍各群體，不受時間和地理位置差異的限制，不但可降低育種成本，穩(wěn)定的遺傳發(fā)展，也是生物安全的保障。

2 應(yīng)用材料與方法

2.1 材料

1）第一批凍精選購，2016年1月從英國選購優(yōu)質(zhì)英系凍精150頭份，公豬血緣4個，細(xì)管規(guī)格0．25 mL，每頭份10劑，精子活力50%以上，畸形率在20%以下，英國專家現(xiàn)場指導(dǎo)，4月開始隨機挑選英系母豬輸精。

2)第二批凍精選購，2017年7月從加拿大選購凍精100頭份，3個公豬血緣，細(xì)管規(guī)格0．25 mL，每頭份10劑，精子活力50%以上，畸形率在20%以下。

3)第三批凍精選購，2017年8月引進(jìn)加系優(yōu)質(zhì)的凍精230頭份，8個優(yōu)質(zhì)血緣。細(xì)管規(guī)格0．25 mL，每頭份10劑，精子活力50%以上，畸形率在20%以下；此次選擇第二胎次的優(yōu)質(zhì)加系母豬作為輸精對象。

2.2 凍精解凍方法

豬精子結(jié)構(gòu)的特殊性使其對溫度變化特別敏感，在凍精解凍過程中極易受到損傷，不僅是導(dǎo)致豬冷凍精液的生產(chǎn)難度大、操作程序復(fù)雜，而且解凍過程必然十分精細(xì)，極大地限制了豬冷凍精液的推廣與應(yīng)用。為此我們探索了幾種解凍方法。

2.2.1 英國凍精解凍方法

1）實驗室室溫調(diào)到26 ℃；

2）選擇公豬，確定1頭份量的精液；

3）準(zhǔn)備水浴鍋，加溫到37 ℃；

4）準(zhǔn)備好新鮮稀釋液，把準(zhǔn)備好的稀釋液放在水浴鍋里至少1 h；

5）在輸精瓶里加60 mL稀釋液；

6）確定你需要的精液的位置；

7）提起液氮罐里的存儲格，使用鑷子取出需要的精液（一次一個）；

8）把3只精液管放在水浴鍋里，解凍；

9）把凍精液存儲格放回液氮罐，蓋好；

10）3 min后取出精液管，使用干凈紙巾擦干；

11）檢查凍精管上的公豬號，別搞錯公豬了；

12）搖動，把氣泡趕到密封口一端（棉花一端）；

13）在棉花端剪開（使用干燥，消過毒的剪刀）；

14）把一端放到37 ℃的輸精瓶里；

15）在37 ℃的輸精瓶里剪開精液管另一端，把精液吹入已經(jīng)加溫到37 ℃的輸精瓶；

16）重復(fù)第7步，直到獲得1頭份精液；

17）把輸精瓶放水浴鍋里30 min；

18）取出輸精瓶后30 min內(nèi)給母豬配種；

19）12 h后重復(fù)該動作；

20）注意事項：第一是解凍過程需要約2 h，所以，在母豬最佳輸精時間開始前2 h進(jìn)行；第二是評估解凍精液的活力，使用前，取出一滴精液，在預(yù)溫到35～38 ℃的玻璃片上鏡檢，檢查其精液活力情況。

2.2.2 加系凍精解凍方法

1）實驗室室溫調(diào)到26 ℃；

2）解凍并恒溫稀釋液為36 ℃（水浴鍋調(diào)到36 ℃并用溫度計進(jìn)行校準(zhǔn)，因為有的水浴鍋的溫度不準(zhǔn)）；

3）打開第二個水浴鍋，調(diào)到整50 ℃（解凍精液細(xì)管用）。也可以用保溫杯（采精杯）來代替，用溫度計調(diào)到50 ℃；

4）打開顯微鏡，準(zhǔn)備載波片和蓋波片，待檢測精子活力；

5）待稀釋液恒溫36 ℃，解凍水溫到整50 ℃；

6） 打開液氮罐蓋；

7）看準(zhǔn)標(biāo)簽，找到需要配種的品種豬號；

8）拉動精液細(xì)繩，拉出精液包（注：精液包不能高于液氮灌口）；

9）快速熟練地解開精液包，拿出精液細(xì)管，將精液細(xì)管快速放到50 ℃水里，并同步打開秒表，計時16 s。同時用棍棒把精液包捅到液氮面下方。注：精液細(xì)管放到50 ℃水里，不漂浮，不粘連，不起霜；

10）計時16 s到，拿出精液細(xì)管，并擦干；

11）剪開精液細(xì)管空氣端，大概1 cm；

12）用精液杵棒，杵棉塞端將精液杵進(jìn)稀釋液；

13）輕輕搖勻（動作不能太激烈）；

14）均勻取樣（精液瓶中下端）；

15）檢測精液活力；

16）合格后，馬上配合深部輸精管去配種。

圖1 精液自動檢測

2.2.3 加拿大加系凍精解凍方法

1）實驗室室溫調(diào)到26 ℃；

2）在自動恒溫36 ℃的解凍杯里注滿蒸餾水并連接打開電源，加溫30 min以上；

3）按1頭份稀釋液/（60 mL蒸餾水，3 G營養(yǎng)粉），準(zhǔn)備好稀釋液，將準(zhǔn)備好的稀釋液放入26 ℃的水浴鍋中，加溫40 min以上；

4）將備用的輸精空瓶放在26 ℃的水浴鍋里預(yù)溫30 min，注意不要污染輸精瓶；

5）將中轉(zhuǎn)杯（2升保溫杯）倒入三分之一的液氮，備用；

6）打開液氮罐，選擇需要的公豬耳號，用鑷子取出1頭份量(8支)的精液，放入中轉(zhuǎn)杯中，蓋好液氮罐。取的過程中要核查公豬耳號，避免搞錯；

7）從中轉(zhuǎn)杯中取2支精液放入36 ℃的自動恒溫解凍杯中，靜置20 s，取出，用干凈紙巾擦拭干凈；

8）晃動精液管，把氣泡趕到密封口的一端（金屬球一端），用干凈的剪刀在金屬球下端剪開；

9）將剪開端放入（注意不要與輸精瓶接觸）經(jīng)過26 ℃預(yù)溫的輸精瓶里，用專用的金屬棒捅管子的棉球，擠出精液，流入輸精瓶里；

10）重復(fù)7-9步驟，直到獲得1頭份精液的量，向有精液的輸精瓶里倒入準(zhǔn)備好并預(yù)溫26 ℃的稀釋液60 mL，并蓋好瓶蓋，在瓶身上寫好公豬耳號。在30 min內(nèi)進(jìn)行配種為佳；

11）將解凍好的精液瓶放入37 ℃的水浴鍋里放置15～30 min，進(jìn)行精子復(fù)蘇；

12）檢查精子活力：取出經(jīng)過復(fù)蘇的精液，取1滴精液，放在37 ℃的恒溫載物臺上，在精子密度儀上檢查活力；

13）在從液氮罐中取精液的過程中，注意佩戴防護(hù)用具，避免凍傷。

表1 精液自動分析情況

2.3 精子活力雜透明度情況分析

公豬精液稀釋后，檢查精子活力，取1滴精液，放在37 ℃的恒溫載物臺上，在精子密度儀上檢查活力情況。

2.3.1 精液自動分析情況

2.3.2 精液自動檢測圖片

2.4 輸精方法的研究

豬的凍精輸精方法有子宮頸輸精法、子宮輸精法和輸卵管輸精法；我們采用了前2種深部輸精法，稀釋液的選用按凍精要求自配稀釋液進(jìn)行配制。

2.4.1 內(nèi)軟噴管深部子宮頸輸精方法

1）凍精解凍稀釋的精液在1 h內(nèi)必須使用；

2）輸精前的準(zhǔn)備和常規(guī)輸精法一樣；

3）將深部輸精管頭插入子宮頸處鎖住，輸精時采用爆發(fā)力擠壓精液瓶進(jìn)行輸精；

4）輸精時圖片（見圖2）。

圖2 輸精

2.4.2 內(nèi)硬細(xì)管深部子宮體輸精方法

1）凍精解凍稀釋的精液在1 h內(nèi)必須使用；

2）輸精前的準(zhǔn)備和常規(guī)輸精法一樣；

3）將深部輸精管橡皮軟頭插入子宮體處，輸精時采用緩慢擠壓內(nèi)吸方式進(jìn)行輸精；

4）輸精時圖片(見圖3)。

以上2種深部輸精法都可用，效果都較好。

圖3 輸精

3 結(jié)論與效益分析

凍精可以使優(yōu)良基因得到無限期的保存（如本地豬種或優(yōu)良種豬資源保護(hù)），延長優(yōu)良公豬不受該公豬死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為使用高性能水平的優(yōu)良種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，獲得更大的遺傳進(jìn)展。

3.1 凍精記錄情況

3.1.1 配種產(chǎn)仔情況

1）英系凍精共配種45頭，分娩5窩，總產(chǎn)仔數(shù)為25頭，其中產(chǎn)活仔數(shù)為20頭，死胎3頭，畸胎2頭，平均窩產(chǎn)仔數(shù)5頭，窩產(chǎn)活仔數(shù)為4頭，產(chǎn)活仔率為80%。

2）加系凍精共配種26 頭，分娩19 窩，總產(chǎn)仔數(shù)為160頭，其中產(chǎn)活仔數(shù)為155頭，死胎5頭，畸胎0頭，平均窩產(chǎn)仔數(shù)8．42頭，窩產(chǎn)活仔數(shù)為8．16 頭，產(chǎn)活仔率為 96．88%。

3）加拿大凍精共配種49頭，分娩29窩，總產(chǎn)仔數(shù)為203頭，其中產(chǎn)活仔數(shù)為194頭，死胎9頭，畸胎0頭，平均窩產(chǎn)仔數(shù)7頭，窩產(chǎn)活仔數(shù)為6．69頭，產(chǎn)活仔率為 95．57%。

3.1.2 仔豬初生重高床豬舍53頭母豬總產(chǎn)活仔數(shù)369頭，仔豬總重為557kg，平均窩重10．51 kg，平均每頭重為1．51 kg。

3.1.3 育成仔豬數(shù)

到目前為此，仔豬23天斷奶計，高床豬舍有6 頭患有腹瀉情況，意外壓死4 頭，369頭總產(chǎn)活仔中總育成仔豬365頭，平均窩育成仔數(shù)6．89頭，育成率98．92%。

3.1.4 斷奶窩重

高床豬舍斷奶活仔365頭，仔豬總重量2829 kg，平均窩重53．38 kg，每頭仔豬 7．75 kg。

3.2 結(jié)論與效益分析情況

1）凍精可以使優(yōu)良基因得到無限期的保存（如本地豬種或優(yōu)良種豬資源保護(hù)），延長公豬使用年限，而不受該優(yōu)良公豬的死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，從而獲得更大的遺傳進(jìn)展；

2）優(yōu)良種豬選擇擴大到世界范圍成為可能，不受時間或地理位置差異的限制，引進(jìn)國外高性能公豬凍精取代進(jìn)行活體引進(jìn)公豬，可節(jié)省部分資金的支出；

3）凍精有利于人工授精體系的完善，公豬冷凍精液可以在后裔測定或疾病檢測后才開始大量應(yīng)用，為穩(wěn)定的遺傳進(jìn)展和嚴(yán)格的生物安全提供額外保障。從生物安全及健康角度考慮，凍精為疾病檢測提供了足夠的時間，凍精還為大型的人工授精站暴發(fā)疾病時提供了穩(wěn)定的精液應(yīng)急供應(yīng)保障；

4）提升效益：可助力養(yǎng)殖場繁殖性能提升30%以上的遺傳效益，將有助于中國豬產(chǎn)業(yè)高效持續(xù)健康發(fā)展；

5）降低成本：可降低養(yǎng)殖場80%左右的引種及飼養(yǎng)成本；

6）方便運輸：更方便企業(yè)優(yōu)質(zhì)基因的運輸、儲存和使用；

7）數(shù)量相當(dāng)：凍精產(chǎn)品有可能達(dá)到鮮精的分娩率及產(chǎn)仔數(shù)水平，最高窩產(chǎn)活仔17頭，凍精和鮮精有可能數(shù)量相當(dāng)；

8）有利于種豬的保種、育種，破解鮮精制約性瓶頸；

9）助力擴繁：助力擴繁場和商品場的種豬永遠(yuǎn)在高起點的基因軌道上騰飛。

總之，開展豬的冷凍精液技術(shù)研究和應(yīng)用，對養(yǎng)殖業(yè)種豬聯(lián)合育種工作和地方豬種資源保護(hù)將具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和積極的社會意義。