蘭州地區幾種不同MTHFR基因及其多態性與早產及葉酸代謝水平關系的研究

呂 玲 肖晨光 陳 雪 王 連 閆有圣 郝勝菊

1.甘肅省婦幼保健院( 蘭州， 730050)；2.中核蘭州鈾濃縮公司職工醫院；3.甘肅省婦幼保健院醫學遺傳中心

早產問題已成為全球性醫療問題以及研究的熱點，其不但導致兒童發病、死亡以及出現的相關后遺癥，而且導致孕婦以及早產兒成人后罹患各類疾病的風險。早產發病率隨地域、種族和國家等的不同而存在差異。有研究甘肅省早產的發生率為9.6%，28.0%的新生兒死亡原因與早產有關[1]。目前對于早產的遺傳研究多針對基因多態性范疇，其中研究有關葉酸代謝途徑相關代謝酶基因與早產關系成為熱點，MTHFR為葉酸代謝途徑中的一類限速酶。研究顯示，MTHFR(C677T)基因多態性與圍產兒早產、心血管疾病的發生發展密切相關[2]。目前已有研究發現，MTHFR基因中的MTHFR (A1298C)、MTHFR (G1793A)及MTHFR (C2572A)基因多態性與糖尿病、胃癌以及類風濕關節炎等相關[3-4]，但是這3種基因多態性與早產以及葉酸代謝的關系研究報道較少。本研究探討上述3種基因多態性與早產、葉酸代謝的關系，為臨床早期診斷早產發生風險以及葉酸是否缺乏提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月—2016年7月在本院產科出生的部分新生兒及其母親298例，按照新生兒是否早產，將新生兒母親分為早產組(早產組)和正常組(正常組)。兩組研究對象知情同意并均簽訂知情同意書。

1.2 納入和排除標準

早產兒入選標準：妊娠在28～37周出生的漢族單胎活產新生兒；非人工引產或者因意外事件導致的早產；經臨床診斷符合早產；母親妊娠期間無吸煙、吸毒以及酗酒等情況；母親以及早產兒均未有輻射源接觸史；母親無嚴重的全身或者宮內感染，妊娠期間未亂用或者濫用藥物史；無家族遺傳史或者家族傳染史等。足月兒入選標準：妊娠>37周分娩漢族單胎活產新生兒；屬于自然受孕、自然分娩，新生兒出生體重在2500g～4000g，未出現嚴重全身系統性疾病；母親妊娠期間未服用任何藥物、未出現吸煙、吸毒以及酗酒等情況；母親以及新生兒均未有輻射源接觸史；體檢合格。排除標準：新生兒出生時有顱內出血、呼吸窘迫綜合癥、巨大兒等；腦癱兒或者其他神經系統疾病新生兒。

1.3 研究方法

1.3.1臨床資料的收集采用自編的調查問卷和記錄表，收集入選對象的門診病歷以及住院時的數據資料：新生兒出生史、性別、出生時胎齡；新生兒母親健康狀況、既往病史、家族史、文化程度、工作環境以及家庭經濟狀況等。

1.3.2基因多態性檢測DNA提取：抽取各新生兒母親肘靜脈血3 ml，置EDTA抗凝管中，采用基因組DNA提取試劑盒(美國Omega公司)提取白細胞中的DNA，并于-80℃保存。基因位點的選擇以及引物合成：通過NCBI基因數據庫選擇候選基因，打開SNP中Geneview鏈接，選擇3UTR區、EXON區對蛋白質水平有影響的3種SNP位點，選取的3個基因位點在中國漢族人群中最小等位基因頻率在0.05以上，綜合文獻檢索，信息核對無誤后篩選以下3個SNP位點。采用Assay Designer 3.1軟件設計PCR引物(引物有上海生工生物有限公司)，引物序列見表1。

表1 引物序列列表

1.3.3 PCR-RFLP法檢測PCR反應總體系為25μl，其中含有2.5μl的10×緩沖液、1.5μl氯化鎂(25 mmol/L)、2μl的dNTP(2.5mmol/L)、PCR引物各1.25μl、DNA模板2μl，0.5μl Tag DNA合成酶，剩余加上雙蒸水至25μl。PCR擴增條件：95℃預變性3min，94 ℃變性30s，56℃退火40s，73 ℃延伸30s，共計39個循環，最后73℃延伸5min。采用限制性內切酶消化PCR產物，其中MTHFR (A1298C)基因位點采用Mbo-Ⅱ內切酶、G1793A位點采用BsrbⅠ內切酶，C2572A位點采用StyⅠ內切酶。酶切體系：2μl的10×緩沖液、2μl小牛血清、5.5μl的雙蒸水，內切酶0.5μl，PCR產物10 μl，反應總體系20μl。采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察記錄電泳結果。MTHFR (A1298C)基因位點經酶切后，AA型產生56bp、31bp、30bp、28bp、18bp 5個片段；AC型產生84bp、31bp、30bp、18bp 4個片段；CC型產生84bp、56bp、31bp、30bp、28bp、18bp 6個片段。MTHFR (G1793A)基因位點經酶切后，AA型產生310bp 1個片段；AG型產生310bp、233bp、77bp 3個片段；GG型產生233bp、77bp 2個片段。MTHFR(C2572A)基因位點經酶切后，CA型產生177bp、136bp、41bp 3個片段;CC型產生177bp 1個片段；AA型產生136bp、41bp 2個片段。

1.3.4血清中葉酸、維生素B12以及同型半胱氨酸(Hcy)及其他生化指標的檢測所有新生兒母親隔夜禁食12h，于次日清晨空腹抽取肘靜脈血3 ml，30min內分離血清，置-80℃冰箱。采用化學發光免疫分析法測定維生素B12以及葉酸濃度(美國羅氏E601化學發光免疫分析儀)；采用循環酶法(試劑盒為上海德賽診斷有限公司)測定Hcy濃度。

1.4 統計學方法

所有研究對象的調查問卷所含有資料以及PCR-RFLP分析結果均錄入到Microsoft office Excel 2007中進行統計。采用SPSS17.0統計軟件對收集的數據行統計學分析，多態性基因頻率分布采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。對于計量資料采用單因素方差分析、SNK-Q檢驗，計數資料采用χ2檢驗，單因素、多因素分析采用非條件的logistic回歸分析，統計比值比(OD)，95%置信區間(95%CI)以及行Waldχ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

本研究最終納入早產兒154例，足月兒144例。其中男性187例，女性111例，均為出生1～3周，母親的妊娠年齡(27.3±3.7)歲(24～34歲)。兩組研究對象新生兒性別構成比、母親的文化程度、經濟收入以及妊娠年齡方面差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1 一般臨床資料比較

早產組新生兒男性96例(62.34%)、女性58例(37.7%)，正常組新生兒男性91例(63.2%)、女性53例(36.8%)，兩組新生兒性別構成比無差異(P>0.05)。早產組與正常組在文化程度、年收入以及妊娠年齡方面差異無統計學意義(P>0.05)，但葉酸、維生素B12水平低于正常組，而同型半胱氨酸(Hcy)水平高于正常組(均P<0.05)。見表2。

2.2 3種基因PCR擴增情況

采用RT-PCR檢測發現，3種MTHFR基因擴增條目清晰，經sanger測序法測定基因序列，結果圖1～3。

表2 兩組一般臨床資料比較

1,5 AA型；2,3,6 AC型；7 CC型; 4 Marker圖1 MTHFR(A1298C)基因位點多態性電泳及基因測序圖

1,5 GA型；2 GG型；4 AA型；3 Marker圖2 MTHFR(G1793A)基因位點多態性電泳及基因測序圖

1,3 CC型；2,6 CA型；5 AA型；4 Marker圖3 MTHFR (C2572A)基因位點多態性電泳及基因測序圖

2.3 3種基因多態性在新生兒母親中分布

早產組與正常組MTHFR (A1298C)、MTHFR (G1793A)及MTHFR (C2572A)位點等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，表明符合群體代表性。MTHFR (A1298C)基因，早產組AC型、AA型以及C、A等位基因頻率分布與正常組比較有差異(P<0.05)；MTHFR (G1793A)基因，早產組GG型、AA型以及G、A等位基因頻率分布與正常組比較有差異(P<0.05)；MTHFR (C2572A)基因，AA+CA型及C、A等位基因頻率分布與正常組比較有差異(P<0.05)。見表3。

表3 3種MTHFR基因多態性在兩組新生兒母親中的分布比較

2.4 不同基因型母親葉酸、維生素B12及Hcy水平

MTHFR (A1298C)基因中，AC型、CC型母親葉酸、維生素B12水平均低于AA型母親(t=4.129、5.038、6.620，P<0.05)。MTHFR (G1793A)基因中，GA型、AA型母親葉酸、維生素B12均低于GG型母親(t=8.253、6.046、4.338，P<0.05)；AA型母親葉酸、維生素B12水平均低于GA型母親(t=5.526、4.397，P<0.05)，而Hcy水平顯著高于GA、GG型母親(t=4.391、5.206，P<0.05)。MTHFR(C2572A)基因AA+CA型母親葉酸、維生素B12水平均顯著低于CC型母親(t=5.592、4.085，P<0.05)，而Hcy顯著高于CC型(t=5.583，P<0.05)。見表4。

表4 早產兒母親組血清中3種基因型葉酸、維生素B12及Hcy水平表達

*與AA型比較△與GG型比較#與GA型比較P<0.05

項 目 MTHFR ( G1793A )基因型 GG GA AA F PMTHFR (C2572A)基因型 CC AA+CA F P 葉酸(μg/L)14.8±3.911.2±4.8△8.8±3.7△#7.620.01315.6±4.310.4±4.1* 9.730.007維生素B12(μg/L)534.3±179.0401.6±173.3△330.4±161.5△#15.920.000521.6±182.1358.9±167.5*19.220.000Hcy(μmol/L)13.7±3.114.7±4.015.4±4.2△5.740.02913.7±3.215.6±4.1*6.010.019

*與AA型比較△與GG型比較#與GA型比較P<0.05

2.5 早產危險因素分析

將3種基因型以及等位基因頻率、葉酸、維生素B12以及Hcy納入自變量，以早產為因變量(是為0，否為1)行非條件的logistic回歸分析。結果顯示，葉酸(OR=2.64，95%CI 1.56～5.94，P=0.007)，維生素B12(OR=1.77，95%CI 1.24～4.61，P=0.019)；MTHFR (A1298C)基因AC+CC型(OR=1.54，95%CI 1.11～3.69，P=0.041)；MTHFR (G1793A)基因GA+AA型(OR=1.94，95%CI 1.33～5.11，P=0.028)，MTHFR (G1793A)基因A等位基因頻率(OR=1.77，95%CI 1.13～4.03，P=0.039)；MTHFR (C2572A)基因AA+CA型(OR=1.65，95%CI 1.02～4.15，P=0.042)為早產的影響因素。

3 討論

目前，早產遺傳學研究多集中在基因多態性，研究相關的多態性基因分型與血清中生化指標、環境因素的相互作用。通過對文獻檢索顯示，目前研究與早產相關基因主要有炎性反應相關基因、凝血相關基因、葉酸代謝酶相關基因等。其中葉酸代謝酶相關基因為當下研究的熱點。葉酸參與機體的諸多生化代謝反應。目前研究發現，在葉酸代謝途徑中一些酶或者基因的多態性參與了神經血管畸形、心血管疾病、唐氏綜合征、乳腺癌、子宮內膜癌、胃癌等疾病的發生發展[3-5]。低葉酸或葉酸缺乏均會不同程度導致心血管病、癌癥的發生發展[6-7]。近年來國內外報道的有關早產者葉酸代謝酶基因的基因位點，主要有MTHFR C677T，MTHFR A1298C、甲硫氨酸合酶(MTR)D919G，甲硫氨酸合酶還原酶(MTRR)A66G等。本研究主要是針對葉酸代謝限速酶MTHFR基因的相關基因，以期為臨床診斷提供一定的理論基礎。

目前對于MTHFR基因多態性研究已很深入，其中C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)、G1793A(rs2274976)、C2572A(rs4846049)以及rs4846048等幾個基因位點成為研究熱點，而對于與早產、葉酸代謝相關的基因位點研究主要集中在C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)兩個基因位點。本研究探討其他的基因是否與早產以及葉酸代謝相關，通過文獻檢索發現，A1298C(rs1801131)、G1793A(rs2274976)、C2572A(rs4846049)3個基因位點均與低葉酸有關。文獻顯示，A1298C(rs1801131)基因位點與先天性心臟病、非綜合性唇腭裂、早產等有關[8-9]。而對G1793A(rs2274976)、C2572A(rs4846049)等研究主要是針對癌癥以及心血管疾病，目前的研究文獻報道較少，這兩種基因對于早產、葉酸代謝的影響研究，本研究可能屬于首次，這也是本研究的創新之處。

中國5歲以下兒童死亡監測數據表明，早產是我國新生兒死亡的第3位死因。近兩年來本院住院分娩統計顯示，早產發病率達到9.8%[10-11]。由于環境地域的不同，可能導致基因突變出現變化，從而對葉酸、維生素B12等物質吸收產生影響。本文選擇研究的3種MTHFR基因位點與孕婦早產、葉酸代謝的關系，以期為本地區早產的早期診斷提供一定的理論基礎。通過本研究顯示，MTHFR (A1298C)基因中，AC型、CC型母親葉酸、維生素B12水平均顯著低于AA型母親；MTHFR (G1793A)基因中，GA型、AA型母親葉酸、維生素B12水平均顯著低于GG型；MTHFR (C2572A)基因AA+CA型母親葉酸、維生素B12水平均顯著低于CC型母親。表明上述3種不同基因多態性與葉酸代謝顯著相關。通過基因型以及等位基因頻率分布顯示，MTHFR (A1298C)、MTHFR (G1793A)及MTHFR (C2572A)基因位點以及等位基因在正常組、早產組存在一定差異，通過logistic回歸分析顯示，MTHFR (A1298C)基因AC+CC型、MTHFR (G1793A)基因GA+AA型、MTHFR (G1793A)基因A等位基因頻率、MTHFR (C2572A)基因AA+CA型為早產的影響因素，說明上述3種基因多態性與早產有一定的相關性。

綜上所述，MTHFR (A1298C)、MTHFR (G1793A)及MTHFR (C2572A)基因多態性與甘肅地區早產發生及低葉酸水平有關。