張曉春，胡巍娜，王琦

(中國醫科大學附屬第四醫院，沈陽 110032)

尿酸是嘌呤的代謝產物，尿酸產生增多或者尿酸排泄減少可引起血尿酸水平升高。持續的高尿酸血癥會對人類健康造成嚴重的危害。有研究表明，高尿酸血癥是心血管疾病、代謝綜合征、糖尿病、高血壓病、慢性腎病等一系列慢性疾病的獨立危險因素[1]。尿酸的代謝不僅與飲食、生活方式等因素有關，而且與基因、遺傳等因素密切相關[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是目前生命科學研究領域中的熱點。盡管LncRNA通常不直接參與編碼蛋白，但其卻可以在細胞生命活動過程中發揮重要的調控功能[3]。H19基因長度約為2 300 bp，缺乏開放閱讀框架，不具有蛋白編碼功能，屬于LncRNA基因家族的重要成員之一[4]。有研究表明，H19廣泛參與各種病理生理過程的調控，例如H19在胃癌[5,6]、膀胱癌[7]、胰腺癌[8]等多種腫瘤中高表達，發揮癌基因功能，在前列腺癌[9]中低表達，發揮抑癌基因功能。特別值得注意的是，有研究者證實，H19基因的突變(rs217727和rs2067051)與冠心病的發病風險存在密切關系[10]。然而，H19基因是否與高尿酸血癥發病有關目前還沒有被證實。本研究通過對高尿酸血癥患者和正常對照人群外周血中H19基因的基因型進行檢測，探討H19基因多態性與高尿酸血癥發病風險的關系，為高尿酸血癥的早期診斷提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年4月～2012年6月，于中國醫科大學附屬第四醫院體檢中心進行健康檢查的社區居民共187例，入選人群均簽署知情同意書。排除標準：各系統疾病的急性期，嚴重感染、急性創傷、有惡性腫瘤病史、嚴重肝腎功能不全、血液系統疾病、免疫性疾病等炎性疾病、有精神系統疾病等其他各臟器疾病史。187例入選人群中高尿酸血癥者35例(高尿酸血癥組)、尿酸正常者152例(尿酸正常組)。高尿酸血癥診斷標準參照《高尿酸血癥和痛風的治療的中國專家共識》[2]，即男性>420 μmoL/L(7 mg/dL)、女性>360 μmoL/L(6 mg/dL)。高尿酸血癥組男31例、女4例，年齡(54.97±6.60)歲，BMI 26.84±2.99，收縮壓(129.31±15.46)mmHg，舒張壓(81.13±10.95)mmHg，心率(76.49±11.15)次/min，TC(5.42±1.14)mmol/L，TG(2.74±1.58)mmol/L，LDL-C(3.14±0.86)mmol/L，HDL-C(1.18±0.30)mmol/L，肌酐(92.55±15.10)mmol/L，空腹血糖(5.65±1.24)mmol/L；尿酸正常組組男113例、女39例，年齡(55.59±5.93)歲，BMI 25.48±3.02，收縮壓(129.96±16.48)mmHg，舒張壓(77.87±10.19)mmHg，心率(77.87±11.56)次/min，TC(5.27±0.97)mmol/L，TG(2.17±1.66)mmol/L，LDL-C(3.20±0.80)mmol/L，HDL-C(1.32±0.31)mmol/L，肌酐(81.28±14.04)mmol/L，空腹血糖(5.80±1.57)mmol/L；兩組性別、HDL-C、肌酐比較P均<0.05，其他指標比較差異無統計學意義。

1.2 LncRNA H19單核苷酸多態(SNP)位點基因型檢測 抽取所有入選人群空腹左肘前靜脈血3 mL，用EDTA抗凝管收集，用于提取DNA。利用HapMap數據庫對基因多態性進行篩選。采用Haploview4.2選擇中國北京漢族人群(CHB)連鎖不平衡r2值大于0.8，且最小等位基因頻率(MAF)大于5%。采用F-SNP軟件(http://compbio.cs.queensu.ca/F-SNP/)對這些入選位點的可能功能進行預測。最后所選的3個SNP分別為rs2735971A/G(突變位于H19內含子區，MAF=0.133)、rs2839698C/T(突變位于H19內含子區，MAF=0.2929)、rs3024270C/G(突變位于H19內含子區和3′UTR 區，MAF=0.3654)。應用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒從200 μL外周血中提取基因組DNA。操作嚴格按照說明書步驟要求，DNA提取在中國醫科大學附屬第四醫院中心實驗室內完成。為將包有含待測SNP及其部分上游及下游側翼序列的DNA片段通過PCR方法擴增出來。擴增使用的PCR引物序列如下(5′-3′)：rs2735971為CATGTGTATTTC-TGGAGGCTTCCCCTTCAGTCTCACCGCCCGGATGGC-ACRGAATTGGTTGTAGTTGTGGAATCGGAGGTGGC-TGCGCGGCGGCAGTGCAG；rs2839698為CTCGAGG-CAGGGCTGGTGGGGCCTGAGGCCAGTGAGGAGTG-TGGAGTAGGYGCCCAGGCATCGTGCAGACAGGGC-GACATCAGCTGGGGACGATGGGCCTG；rs3024270為GGACGCGGCCCTGCCCAGACCGCCCCGCCGGGC-CACCATCTCACTGCCCCVACCTCTGTCTTCTACAGA-ACACCTTAGGCTGGTGGGGCTGCGGCAAGAAG。將提取的外周血DNA送至上海貝晶生物技術有限公司通過使用競爭性等位基因特異性PCR技術(KASP)進行了基因型檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0進行統計。基因多態性位點與高尿酸血癥發病風險的關系分析采用多重回歸模型，計算風險比(OR)和95%可信區間(CI)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

H19基因3個SNP位點均符合哈德-溫伯格平衡。兩組H19基因不同基因型分布見表1。H19基因3個SNP位點等位基因頻率分布見表2。多重回歸模型結果顯示，與rs2735971 GG基因型相比，GA基因型高尿酸血癥發病風險高(P=0.034，OR=1.959，95%CI：1.051～3.652)；與rs2735971 G等位基因相比，A等位基因高尿酸血癥發病風險低(P=0.001，OR=0.033，95%CI：0.005～0.241)；與rs2839698 TT基因型相比，CC基因型高尿酸血癥發病風險高(P=0.012，OR=3.639， 95%CI：1.329～9.959)；與rs2839698 T等位基因相比，C等位基因高尿酸血癥發病風險低(P=0.000，OR=0.268，95%CI：0.161～0.447)。

表1 兩組H19基因不同基因型分布(例)

表2 兩組H19基因3個SNP位點等位基因頻率分布(%)

3 討論

近年來，高尿酸血癥的患病率呈逐年上升態勢，在某些沿海或者發達地區，高尿酸血癥患病率為5%～23.5%[2]。目前認為環境、生活方式遺傳等多種因素可以影響血尿酸水平，其中遺傳相關的因素在高尿酸血癥發病中的作用越來越被研究者關注。以家族為基礎的一系列研究表明，尿酸水平的高低大概25%～75%歸咎于基因[11,12]。在中國男性人群中的研究發現，P2RX7基因位點rs2230911可以顯著增加罹患高尿酸血癥的發病風險，其中等位基因G與等位基因C比較增加了罹患高尿酸血癥發病風險的1.755倍[13]。一項在歐洲人群中進行的GWAS研究檢測SLC2A9基因相關的3個SNP位點(rs6832439、rs13131257、rs737267)，發現SLC2A9基因多態性與高尿酸血癥的發病可能相關[14]。然而，LncRNA基因是否影響高尿酸血癥目前鮮見文獻報道。

H19基因位于人染色體11p15.5區域，是典型的母系等位基因表達、父系印跡的基因[15]，在人類和嚙齒目動物進化過程中呈現高度保守狀態。它包含有5個外顯子和3個內含子，具有多個C/EBP轉錄因子家族的結合位點[16]。H19基因上游有包含有一個差異甲基化區(MDR)，也稱印跡控制區。該控制區可以通過對其CpG位點甲基化來實現基因表達的控制。通常情況下，H19基因上父系的基因拷貝被甲基化而被沉默，而母系的基因拷貝不被甲基化而選擇性表達。H19基因雖然不能直接編碼蛋白質，但其可以作為調節性的RNA發揮作用[17]，也可以參與編碼微小RNA[18]，參與調節腫瘤發生[5～9]、細胞生殖[19]等病理生理過程。此外，部分研究發現，H19基因的突變與冠心病[10]及多種惡性腫瘤[20～22]的發病風險密切相關。我們的研究探討了H19基因的3個主要SNP位點(rs2735971、rs2839698、rs3024270)與高尿酸血癥發病風險之間的關系。

rs2735971是H19基因上游MDR區核苷酸A/G的變異，該SNP位點在中國漢族和朝鮮族人群中具有較高的檢出率,是比較可靠的遺傳標記[23，24]。Li等[20]對該位點與中國漢族結腸癌患者發病情況進行了分析，但未發現該SNP位點與結腸癌發病風險相關。我們發現，rs2735971多態的GA雜合型增加了患高尿酸血癥的發病風險，這說明GA雜合型可能是高尿酸血癥的患病風險；A等位基因降低了患高尿酸血癥的發病風險，這說明A等位基因模型可能是高尿酸血癥的保護因素。rs2839698是H19基因外顯子區域核苷酸C/T的變異，rs2839698與多種惡性腫瘤的發生密切相關。Li等[20]發現，rs2839698顯著增加中國漢族人結腸癌發病風險，并且與結腸癌的惡性程度顯著相關。Yang等[21]發現，rs2839698多態增加胃癌的發病風險，并且CT和TT基因型攜帶者外周血中H19的表達水平較CC基因型呈現顯著的升高。然而，Verhaegh等[22]卻發現rs2839698多態CT基因型能降低膀胱癌的發病風險。本研究發現,rs2839698位點C等位基因顯著降低了罹患高尿酸血癥的發病風險，提示C等位基因是高尿酸血癥的保護因素，但是基因型分析卻發現CC基因型較TT基因型增加了罹患高尿酸血癥的發病風險，提示CC基因型是高尿酸血癥的風險因子。我們推測rs2839698影響高尿酸血癥的發病可能是由于該位點突變改變了H19基因的二級結構有關[25]。rs3024270是內含子區域核苷酸C/G的變異，在本研究中未發現該位點多態性與高尿酸血癥發病風險存在相關性。

本研究仍存在有一定的不足之處：其一，本研究納入研究的樣本量較小，所得結果有待多中心大樣本的研究來進一步證實；其二，本研究兩組人群存在性別比例的差異，這可能會對研究結果造成一定程度的影響。

綜上所述，LncRNA H19基因rs2735971、rs2839698位點多態性可能與高尿酸血癥的發病風險存在相關性，這兩個位點可能是高尿酸血癥潛在的分子生物學標志物。