結腸癌根治術后患者胸腺肽靜滴輔助FOLFOX4方案化療前后外周血單個核細胞中Treg比例表達觀察

楊飖，宋純，杜濤，韓俊毅

(同濟大學附屬東方醫院，上海 200123)

結直腸癌是消化道最為常見的惡性腫瘤之一。在我國，結直腸癌占惡性腫瘤病死率的第3～4位[1]。目前結直腸癌主要治療方法為手術加放化療，其中FOLFOX4方案化療在中晚期結直腸癌的綜合治療中有不可替代的作用。增強化療藥物的療效，對于改善結直腸癌患者的預后具有重要的意義。腫瘤免疫治療對于改善腸癌患者的預后有著顯著的臨床療效，是近來研究熱點。其中，調節性T細胞(Treg)發揮了重要作用，通過改變體內Treg的表達量，有可能改善腸癌患者的預后。胸腺肽作為一種免疫增強劑被廣泛應用于臨床治療，能非特異性刺激T淋巴細胞的增殖分化和成熟，調節T淋巴細胞亞群比例，增強機體的免疫功能，在腫瘤治療過程中起著重要輔助作用[2-4]。本研究觀察了胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療對結腸癌根治術后患者外周血單個核細胞中Treg比例的影響，從而了解胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療對結腸癌根治術后患者免疫功能的影響及對腫瘤免疫的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2014年6月同濟大學附屬東方醫院接受結腸癌根治術(D3根治術)治療并經病理確診的結直腸癌患者55例，手術均順利完成，無吻合口漏、出血、腸梗阻等并發癥發生。患者術后TNM病理分期證實Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者(Ⅱ期結直腸癌患者含高危因素，包括組織學分化差、T4分期、血管淋巴管浸潤、腸梗阻或穿孔、腫瘤太近切緣、送檢淋巴結小于12枚)，術前未接受放化療及免疫治療，未使用類固醇和免疫抑制劑。患者治療前均簽署知情同意書，治療方案報倫理委員會審批。55例患者中，男26例，女29例；年齡32～86歲；結腸癌24例，直腸癌31例；根據結直腸癌TNM分期，Ⅱ期25例，Ⅲ期30例；根據組織學分級，高分化3例，中分化39例，低分化13例；根據組織學類型，管狀腺癌38例，乳頭狀腺癌13例，黏液腺癌4例；根據腫瘤大體類型，隆起型6例，潰瘍型9例，潰瘍浸潤型40例；病程3～18個月，平均6.5個月。將觀察對象隨機分為T-FOLFOX4組(28例)、FOLFOX4組(27例)。

1.2 胸腺肽靜滴輔助FOLFOX4方案化療方法 所有入組對象在術后2周內接受FOLFOX4方案化療。FOLFOX4方案：奧沙利鉑(注射用奧沙利鉑50 mg/瓶，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)85 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天；亞葉酸鈣(50 mg/支，山西普德藥業有限公司)200 mg/m2靜滴2 h，第1、2天；氟尿嘧啶(浙江海正藥業股份有限公司)400 mg/m2靜注第1、2天；氟尿嘧啶1 200 mg/m2化療持續泵入46～48 h，每2周為1個周期，共12個周期。T-FOLFOX4組在化療基礎上加用胸腺肽(湖南五洲通藥業有限責任公司)200 mg靜脈滴注，第1～5天。

1.3 外周血單個核細胞中Treg比例測算 術后化療前、術后6個月(術后化療12個周期)、術后12個月(化療結束6個月)清晨空腹抽取兩組靜脈血2 mL，EDTA抗凝。吸管加入等體積2 mL的生理鹽水，使血液等倍稀釋。管中充分混勻。另取試管，加入2 mL淋巴細胞分離液(上海生工公司)，離心管傾斜，用一次性滴管將上述稀釋血4 mL在距分離液界面上1 cm處沿管壁緩慢加至分離液上面，稀釋血與分離液之比為2∶1。20 ℃恒溫1 500 r/min離心20 min。離心后，取出離心管，吸取中層單個核細胞，置入另一離心管中。加入生理鹽水吹打均勻后20 ℃恒溫1 800 r/min離心10 min，以去除殘余的分離液和雜質細胞。再次生理鹽水洗滌細胞2次，吹打均勻，配平后每次1 500 r/min離心5 min后重懸，計數并調整細胞密度。在每個流式上樣管中加入經上述離心分離所得兩組結直腸癌患者單個核細胞懸液，每管細胞數約為1×106個，洗滌2遍。分別加入CD4、CD25單抗(美國BD公司)，混勻后4 ℃避光孵育30 min, 1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL破膜劑，4 ℃避光孵育12 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清。實驗組加入稀釋好的熒光標記Foxp3抗體2.5 μL，陰性對照加入IgG對照抗體，4 ℃避光孵育30 min，洗滌，離心，加入500 μL PBS混勻，上機檢測。

1.4 外周血單個核細胞中Treg標志物Foxp3、CD127 mRNA檢測 采用real-time PCR。TRIzol法分別從兩組離心分離所得單個核細胞中提取總RNA，逆轉錄獲取cDNA后進行PCR擴增。Foxp3引物：上游5′-CATGCGACCCCCTTTCACCTAC-3′，下游5′-TCTCCACCCGCACAAAGCACTT-3′。CD127引物：上游5′-AAAGGATGAAAACAAATGGACGC-3′，下游5′-ATGCTGATGGTTAGTAAGATAGGAT-3′。內參基因GAPDH引物：上游5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′，下游5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′。反應體系20 μL,反應條件：95 ℃變性10 s，61 ℃ 10 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。每個測量組取3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果

入組55例對象隨訪12個月，其中49例患者療效可評價。FOLFOX4組1例患者失訪，T-FOLFOX4組2例及FOLFOX4組3例因出現奧沙利鉑神經毒性反應及骨髓抑制等化療毒副作用而退出研究。

2.1 兩組外周血單個核細胞中Treg比例比較 見表1。

表1 兩組外周血單個核細胞中Treg比例比較

注：與FOLFOX4組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 兩組外周血單個核細胞中Treg標志物Foxp3、CD127 mRNA表達比較 見表2。

表2 兩組外周血單個核細胞中Treg標志物Foxp3、

注：與FOLFOX4組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

結直腸癌是發達國家和地區導致人死亡的主要疾病之一，但目前治療效果尚不滿意，根治術后5年總體生存率為50%左右。化療在結直腸癌的綜合治療中起重要作用，尤其是中晚期腸癌患者。然而化療的臨床有效率有限，如何進一步提高化療藥物的療效有著重要的臨床意義。近來研究[5,6]表明，CD4+CD25+Treg能影響機體抗腫瘤免疫功能，與自身免疫耐受和腫瘤免疫密切相關。Treg可以通過分泌TGF-β和IL-10介導細胞免疫抑制，能破壞細胞代謝、溶解細胞，并能影響腫瘤微環境[6,7]。化療藥物的非選擇性殺傷作用對于增殖活躍的Treg細胞也有殺傷作用，使化療后Treg細胞進一步降低，從而也減少了它對腫瘤免疫的抑制。研究[8]發現，腫瘤患者外周血中Treg細胞比例升高，與患者的預后呈負相關。因此，如何調節CD4+CD25+Treg細胞數量已成為抗腫瘤免疫治療的焦點。

胸腺肽已經廣泛應用于肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤及腎癌等惡性腫瘤的治療中，國內亦有應用于結直腸癌的研究[9～11]。基礎研究表明，胸腺肽可促進T淋巴細胞的成熟，增加抗原或絲裂原激活后T細胞分泌的干擾素α、干擾素γ以及IL-2、IL-3等淋巴因子水平，同時增加T細胞表面淋巴因子受體水平，還可通過對CD4+T細胞的激活，增強異體和自體的人類混合淋巴細胞反應，從而增強機體的免疫功能，同時可調節胸腺細胞及B淋巴細胞的分化及成熟及產生多種生物因子[12]。本研究結果顯示，在術后6個月、術后12個月T-FOLFOX4組患者外周血單個核細胞中CD4+CD25+Treg比例較FOLFOX4組顯著下降，表明胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療能顯著下調結腸癌根治術后患者外周血單個核細胞中Treg比例，從而可能進一步抑制腫瘤免疫。叉頭樣轉錄因子家族成員Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞比較特異的形態和功能性指標，被認為是其最敏感的標志物[13,14]。多數CD4+CD25+Treg細胞低表達CD127分子，并且CD127與Foxp3表達負相關[15]。因此，為進一步研究胸腺肽輔助FOLFOX4對CD4+CD25+Treg的影響，我們檢測外周血單個核細胞中CD4+CD25+Treg的標志物Foxp3 mRNA和CD127 mRNA的變化。本研究結果發現，在術后6個月、術后12個月T-FOLFOX4組患者外周血單個核細胞中Foxp3、CD127 mRNA較FOLFOX4組表達降低。

綜上所述，胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療能夠明顯降低結直腸癌根治術后患者外周血單個核細胞中Treg的比例，從而使得化療后機體的細胞免疫功能得到很大的改善，以增強機體免疫監視功能，可為抗腫瘤免疫提供一種新的治療途徑，但胸腺肽介導的抗腫瘤免疫作用的確切機制還有待于深入研究。