非肝炎病毒相關性肝細胞癌組織中鳥苷酸交換因子ECT2的表達變化及其意義

夏念信，趙文超，馬鵬飛，王敬晗，祝建勇，邱寶安

(海軍總醫院，北京 100438)

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是最常見的肝臟原發性惡性腫瘤，為世界范圍內腫瘤所致男性第二位、女性第六位的死亡原因[1]。由于肝癌起病隱匿，大多數患者在確診時已失去手術機會[2]。由于肝癌血管侵犯、遠處轉移、肝內播散的生物學特點，導致其手術效果差，術后復發概率高。因此多學科綜合治療(MDT)策略逐步得到重視。其中靶向藥物的篩查和選擇逐步成為肝癌治療的重要一環。上皮細胞轉化序列癌基因(ECT2癌基因)，其編碼蛋白為鳥苷酸交換因子ECT2。既往的研究表明，ECT2能夠作用于RhoA GTP酶家族成員，通過催化鳥苷酸交換，起到調節細胞分裂的作用[3]。ECT2在多種腫瘤組織中高表達，其產物能夠調控細胞增生與凋亡[4,5]。已有研究表明，ECT2在肝癌術后早期復發病灶樣本中表達水平增加，并與預后相關[6]。但肝癌的致病因素較多，乙肝及丙肝病毒感染所致的慢性肝炎是肝癌發生及早期復發的重要因素。但非病毒相關性危險因子，如乙醇攝入等也發揮了重要作用，且與肝炎病毒相關性是否具備相同的致癌機理尚不明確。本研究觀察了非肝炎病毒相關性肝癌組織中ECT2的表達變化，并探討其與肝癌患者臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源及處理 收集2004年1月～2010年1月海軍總醫院肝膽外科的78例非肝炎病毒相關性肝癌手術切除標本，同時每例患者另取距癌組織2～5 cm處的癌旁組織標本作為對照。78例非肝炎病毒相關性肝癌患者中男56例、女22例，年齡24～69歲、中位年齡54歲，術后病理診斷均為肝癌，以上患者均未行術前新輔助化療或靶向藥物治療。患者隨訪60個月，中位生存時間43個月。將所有標本分兩部分，其中一部分用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片機切成4 μm厚的連續石蠟切片備用；另一部分液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 肝癌及其癌旁組織ECT2蛋白檢測 采用免疫組織化學染色法。常規固定，石蠟包埋，脫蠟、水化后采用三步免疫組化染色法(SP法，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司)檢測ECT2蛋白的表達。具體操作步驟如下：檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，3% H2O2室溫孵育，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加1∶50稀釋的ECT2兔抗人多克隆抗體(Ahmar公司)，4 ℃冰箱孵育過夜，DAB(試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司)顯色，蘇木素對比染色，逐級脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察、攝片并分析。以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。結果判定：免疫組化染色陽性標本的細胞質或細胞膜應呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達，高倍鏡(×400)下隨機觀察5個視野，根據陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析。染色強度：無染色計0分，輕度染色計1分，中度染色計2分，強染色計3分；陽性細胞數<10%計0分,10%～25%計1分,>25%～50%計2分，>50%計3分。將兩項指標評分相乘，0～1為陰性，≥2為陽性。由兩位病理科醫師雙盲法計數，差異超過10%需重新計數。

1.3 肝癌及其癌旁組織ECT2 mRNA檢測 采用RT-PCR技術。按照說明書利用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取肝癌組織及癌旁組織的總RNA，紫外分光光度計測其濃度，而后按照逆轉錄說明書進行逆轉錄，取得cDNA。內參及ECT2引物由Invitrogen公司合成。ECT2引物序列上游：5′-ATTTTATCCACTAGCAAATCTTGATTTAGT-3′；下游：5′-ACAAATCATGGCTGAAAATAGTGTATTAAC-3′，擴增產物為254 bp。GAPDH引物序列上游：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATO-3′；下游:5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，擴增產物為268 bp。PCR反應體系共25 μL:2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板cDNA 1 μL，無核酶水9.5 μL;反應條件94 ℃預變性3 min，然后進行30個循環擴增(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸反應5 min)。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結果。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 非肝炎病毒相關性肝癌及其癌旁組織ECT2蛋白及其mRNA表達比較 非肝炎病毒相關性肝癌及其癌旁組織ECT2蛋白表達陽性率分別為71.8%(56/78)、38.5%(30/78)，ECT2 mRNA相對表達量分別為0.53±0.05、0.38±0.09，兩者比較P均<0.05。

2.2 ECT2蛋白表達與非肝炎病毒相關性肝癌臨床病理特征的關系 ECT2蛋白表達陽性、陰性患者年齡分別為(49.00±5.65)、(53.00±4.32)歲，兩者比較P>0.05。ECT2蛋白表達與非肝炎病毒相關性肝癌其他臨床病理特征的關系見表1。

3 討論

肝癌一直是治療的難題，外科切除仍然是最有效的手段。然而，由于肝癌起病較隱匿，大多數患者確診時已無法手術切除；另外，即便是接受了根治性手術，術后腫瘤的復發和轉移仍然是影響手術效果的首要原因。

表1 ECT2蛋白表達與非肝炎病毒相關性肝癌

基于上述現狀，MDT逐步成為腫瘤治療的基本理念。在此背景下，尋找肝癌發生發展過程中的基因變化，作為藥物治療的靶點，有著重要的臨床意義。ECT2基因定位于人染色體3q26.31，具有高度的進化保守性，由883個氨基酸編碼構成的蛋白質，相對分子質量約為104 000[7]。研究發現，其在多種腫瘤細胞中高表達，因此也被視為癌基因[8]。ECT2通過作用于Rho GTP酶家族成員，催化鳥苷酸交換，從而起到調節細胞分裂的作用[9]；同時，由于Rho GTP酶家族成員對細胞的骨架重構及黏附性調節方面亦發揮重要作用，因此ECT2還與腫瘤的侵襲性顯著相關[10]。有研究發現，在卵巢癌及肺癌細胞中ECT2可以激活Rac1基因，輔助Rac1在細胞核中募集，促使細胞癌變及增殖。敲除ECT2基因則會抑制肺腺癌細胞的增生及侵襲性[11,12]。結合患者的臨床病理數據，ECT2高表達與肺鱗癌患者的總生存時間及無瘤生存時間均顯著相關[11]。在非小細胞性肺癌中也有發現類似的結果[13]。同時，ECT2也作為各種腫瘤調節因子的作用靶位發揮作用。在非小細胞肺癌及乳腺癌細胞系上發現野生型p53基因可以通過作用于蛋白甲基轉移酶抑制ECT2的表達。而泛素連接酶之一E6AP，也是通過ECT2依賴的機制，發揮調節腫瘤轉移的作用[14]。基于上述一系列發現，ECT2已作為腫瘤細胞轉化、播散過程中的重要參與者，有著重要的應用前景。

目前，針對ECT2在肝癌發生、發展領域的研究較少。一項來自新加坡國立癌癥中心的研究發現，ECT2在肝癌組織中表達顯著升高，并且與腫瘤早期復發顯著相關。進一步的機制研究提示，ECT2在細胞增殖、癌基因轉化、腫瘤發生發展及轉移過程中均發揮了重要角色，ETC2/Rho/ERK信號通路部分介導了ECT2的功能[6]。但在該研究中，并未根據病因將肝癌分別進行研究。大量研究證實，肝癌的發生與肝炎病毒感染所致慢性肝病顯著相關。然而，非肝炎病毒相關性肝癌亦占據一定比例。兩者在發生、發展過程中是否具備相同的機制仍無定論。既往大多數肝癌的研究并未根據肝癌的成因進行分類，大多數納入標本均為肝炎病毒相關性肝癌，缺乏對非肝炎病毒相關性肝癌相關機制的探索。基于此，本研究在前述研究的基礎上，分析了ECT2在非肝炎病毒相關性肝癌組織中的表達并初步分析其臨床意義。本研究結果發現，非肝炎病毒相關性肝癌組織ECT2蛋白及mRNA表達高于癌旁組織。上述結果均提示，在非肝炎病毒相關性肝癌組織中，ECT2也呈現高表達狀態。表明，在這類肝癌的發生發展過程中，ECT2基因及其表達產物參與其中并發揮了重要作用。目前的研究表明，腫瘤的生物學特點，包括分化程度、侵襲性、血管生成、免疫原性等，是腫瘤復發、轉移的基礎。基于上述共識，我們選擇性收集了目前公認的與腫瘤生物學特征直接相關的指標，并評價其與ECT2表達的關系。結果提示肝癌患者低腫瘤分化者、腫瘤直徑≥5 cm者、甲胎蛋白水平≥100 ng/mL者、有微血管癌栓者均較中高腫瘤分化者、腫瘤直徑<5 cm者、甲胎蛋白水平<100 ng/mL者、無微血管癌栓者ECT2蛋白表達陽性例數多。大量研究表明，甲胎蛋白水平與原發性肝癌的分化程度及預后顯著相關[12]，甲胎蛋白水平越高，預示著腫瘤分化程度低，無論是手術還是移植后復發轉移概率顯著增加。經過門靜脈系統肝內轉移是肝癌的主要轉移途徑，因此術后病理切片提示微血管癌栓的出現被認為是術后復發的主要危險因素之一[15]。同時微血管癌栓的發生也反映了腫瘤細胞黏附性的改變。本研究結果與既往ECT2調節細胞的骨架重構及黏附性的研究發現一致。通過與上述臨床病理特征的比較，表明ECT2的表達與非肝炎病毒相關性肝癌的生物學特征顯著相關，直接參與了腫瘤的轉移和復發，有著重要的臨床意義。

綜上可見，非肝炎病毒相關性肝癌組織中ECT2表達高，ECT2蛋白表達可能與肝癌的復發、轉移有關。表明通過抑制ECT2表達，有可能降低腫瘤的發生，這為原發性肝癌患者及其他腫瘤患者的預后判斷及靶向治療靶點的選擇提供重要的實驗基礎及理論基礎，為以后的研究提供重要線索。