正交試驗法優化平臥菊三七多糖GPP-20雙氧水脫色工藝研究

韓藝，王文君，2，李慶華，李景恩，2，*

（1.江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌330045；2.江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

平臥菊三七（Gynura procumbens（Lour.）Merr.）為菊科三七屬多年生草本植物，又名平臥土三七、蛇接骨、續命草、神仙草，多生于林間、溪旁、坡地的沙質土壤，在我國南方廣泛分布[1-2]。根和莖都是中草藥的上等原料，其味甘淡，藥性平和，食之具有疏通經脈、止咳、消炎、消腫化淤、活血生肌之功效，內含黃酮類[3-4]、綠原酸[5-6]、萜烯類[7]、多酚類[8]類等活性成分，具有良好的抗氧化[9]、抗炎[10]、抗菌[11-12]、降血糖[13-15]、降血脂[16]、保肝[17-18]等藥理活性。由此可見，作為一種新資源食品，平臥菊三七具有良好的開發前景。

課題組前期利用乙醇分級沉淀法對平臥菊三七粗多糖（Gynura procumbens polysaccharide，GPP）進行初步純化，于不同乙醇濃度（20%，40%，60%，80%）分別得到 GPP-20、GPP-40、GPP-60和 GPP-80 4 個新組分，其中GPP-20較其他3個組分具有明顯的清除羥基自由基和超氧自由基的作用[19]。但因其溶于水后呈深褐色，不僅影響多糖外觀，還會對吸光度檢測造成一定的影響，不利于后續結構鑒定和藥理活性等相關研究。針對以上問題，本試驗擬采用雙氧水法對GPP-20進行脫色研究，以期為平臥菊三七多糖的深入研究與開發提供一定的理論基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平臥菊三七粗多糖：由江西農業大學食品科學與工程學院天然產物與功能食品實驗室自制。

葡萄糖：西隴化工股份有限公司；無水乙醇：西隴科學股份有限公司；30%雙氧水：天津市永大化學試劑開發中心；濃硫酸：國藥集團化學試劑有限公司；苯酚：天津市大茂化學試劑廠。以上試劑均為分析純。

V-5600型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；BDC-555WKM型電冰箱：合肥美的榮事達電冰箱有限公司；FA1004型電子天平：上海力辰有限公司；DZF-6090Z型真空干燥箱：上海躍進醫療器械有限公司；XH-C型旋渦混合器：金壇市白塔新寶儀器廠；TGL-16GB型高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；HH-60型數顯恒溫攪拌水箱：國華電器有限公司；CT-6022型手持式pH計：柯迪達公司。

1.2 方法

1.2.1 GPP-20多糖的制備

稱取一定量的平臥菊三七粗多糖完全溶解于蒸餾水中，緩慢加入無水乙醇進行攪拌。當乙醇濃度達到20%（體積分數），于4℃冰箱中靜置12 h后離心（4 800 r/min，10 min）。將所得沉淀復溶于水，透析除去乙醇，然后進行冷凍干燥，即得GPP-20組分。

1.2.2 脫色率的計算

精密稱取10 mg GPP-20多糖置于10 mL容量瓶中加蒸餾水定容，配制成濃度為1 mg/mL的稀溶液，在可見光區（400 nm～760 nm）進行最大吸收波長掃描，結果見圖1。

圖1 波長掃描試驗Fig.1 Wavelenth scanning experiment

由圖1可見，GPP-20溶液在可見光區無最大吸收峰，又因試驗濃度下多糖溶液呈淡黃色，因此從溶液互補色角度考慮，選取450 nm作為脫色率的檢測波長，并按公式（1）計算脫色率。

1.2.3 多糖保留率的計算

1.2.3.1 標準曲線的制備

精密稱量100 mg葡萄糖對照品，定容于100 mL容量瓶，配制成1 mg/mL的母液；再取10 mL母液定容于100 mL容量瓶，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖溶液；然后將其稀釋成濃度為 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的工作溶液，分別置于6只試管內。每只試管先后加入0.5 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，振蕩混勻后室溫靜置30 min[20]。用蒸餾水代替多糖液作為空白對照組，于490 nm波長下測定其吸光度，最后以葡萄糖濃度（C，μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程。

1.2.3.2 樣品含量的測定

分別將脫色前和脫色后的GPP-20溶液（1 mg/mL）稀釋10倍，按照“1.2.3.1”中苯酚-硫酸法測定樣品吸光度，然后通過回歸方程計算樣品中葡萄糖濃度，根據公式（2）（3）計算多糖含量及保留率。

1.2.4 單因素試驗

稱取500mgGPP-20多糖，加蒸餾水配制成1mg/mL的溶液，用于單因素試驗，分別考察雙氧水加入量、脫色溫度、脫色時間、pH值對脫色效果（脫色率和多糖保留率）的影響。為避免苯酚被氧化，顯色前必須將反應液中過量的過氧化氫，以二氧化錳作為催化劑快速分解去除。直至試管中無明顯氣泡產生，表示過氧化氫基本分解完全，離心除去二氧化錳，取上清液待測。

1.2.4.1 雙氧水加入量對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入6根試管內，pH值保持不變，加入不同體積的雙氧水，使其終濃度分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%，然后于50℃恒溫水浴4 h，取出放置室溫后，分別計算脫色率和多糖保留率。

1.2.4.2 脫色溫度對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入6根試管內，加入一定量雙氧水，使其體積分數為9%，調節溶液 pH 值為 8，分別在 30、40、50、60、70、80 ℃的溫度下恒溫水浴4 h，分別計算脫色率和多糖保留率。

1.2.4.3 反應時間對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入6根試管內，加入一定量雙氧水，使其體積分數為9%，調節溶液 pH 值為 8，于 50℃恒溫水浴中分別反應 1、2、3、4、5、6 h，然后取出計算脫色率和多糖保留率。

1.2.4.4 pH值對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入7根試管內，加入一定量雙氧水，使其體積分數為9%，調節溶液 pH 值分別為 4、5、6、7、8、9、10，50 ℃恒溫水浴 4 h，分別計算脫色率和多糖保留率。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗基礎上，對雙氧水加入量（A）、脫色溫度（B）、脫色時間（C）和pH值（D）進行四因素三水平L9（34）正交試驗，各因素及水平設計如表1所示。試驗數據采用綜合加權評分法，多糖脫色率（X）和多糖保留率（Y）的權重系數均為0.5，則綜合評分Z=0.5（X+Y）。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 驗證試驗

取5份1 mg/mL的GPP-20多糖溶液，按照正交試驗優化得到的最佳脫色條件進行反應，計算脫色率及多糖保留率，驗證其是否為最佳脫色條件。

1.2.7 統計分析

采用DPS數據處理系統進行單因素方差分析和LSD多重比較，字母標注法表示數據間的差異關系。無相同字母表示差異顯著，有一個相同字母表示差異不顯著，其中小寫字母表示顯著水平α=0.05，大寫字母表示顯著水平α=0.01。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

按照1.2.3.1方法制備葡萄糖標準曲線，結果見圖2。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 The standard curve of glucose

如圖2所示，在試驗范圍內，葡萄糖（0～0.1 mg/mL）與吸光度呈良好的線性關系，回歸方程為A=0.007 1C+0.027 4，其中A為吸光度，C為葡萄糖濃度，線性系數R2=0.996。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 雙氧水加入量對多糖脫色效果的影響

不同雙氧水加入量對脫色率及多糖保留率的影響見圖3。

圖3 雙氧水加入量對多糖脫色率及保留率的影響Fig.3 Effect of addition amount of H2O2on the decolorization rate and retention rate of polysaccharides

由圖3可見，隨雙氧水加入量的增加，脫色率逐漸升高，而多糖保留率逐漸降低。經統計學方差分析和多重比較發現，雙氧水加入量為9%～15%范圍內，多糖保留率無顯著降低（p＜0.05）；但當雙氧水加入量為18%時，保留率極顯著下降（p＜0.01），此時脫色率較之前并未明顯增大（p＜0.01），因此為避免多糖損失過多，選取雙氧水加入量為9%、12%、15%進行正交試驗。

2.2.2 脫色溫度對多糖脫色效果的影響

不同反應溫度對脫色率及多糖保留率的影響見圖4。

圖4 脫色溫度對多糖脫色率及保留率的影響Fig.4 Effect of decolorization temperature on the decolorization rate and retention rate of polysaccharides

由圖4可見，隨溫度的升高，多糖脫色率逐漸增高，保留率逐漸降低。方差分析結果顯示，在60℃～70℃附近，二者變化均趨于穩定。當溫度升高為80℃，多糖脫色率顯著升高（p＜0.01），保留率顯著降低（p＜0.01），由52.26%（70℃）降至 44.92%（80℃），糖保留率過低，因此選取50、60、70℃3個水平進行正交試驗。

2.2.3 脫色時間對多糖脫色效果的影響

不同反應時間對脫色率及多糖保留率的影響見圖5。

圖5可見，隨脫色時間的增加，脫色率逐漸增高，當脫色時間由5 h延長至6 h時，脫色率并無顯著性升高（p＜0.05）；多糖保留率在1 h～4 h內顯著下降（p＜0.01），4 h后基本趨于穩定。從節約時間，提高效率的角度出發，選取脫色時間3、4、5 h進行正交試驗。

2.2.4 pH值對多糖脫色效果的影響

不同pH值對脫色率及多糖保留率的影響見圖6。

圖6 pH值對多糖脫色率及保留率的影響Fig.6 Effect of pH value on the decolorization rate and retention rate of polysaccharides

由圖6可見，隨著溶液pH值的升高，多糖脫色率逐漸增大，說明堿性條件有利于脫色，而多糖保留率在pH＜6或pH＞9的條件下均處于較低水平。當pH＞9時，雖然脫色率極顯著上升（p＜0.01），但多糖保留率由78.45%降至 71.20%，發生顯著性下降（p＜0.01），綜合考慮后選取pH值7、8、9進行正交試驗。

2.3 正交試驗結果

正交試驗設計及直觀分析結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗設計及直觀分析結果Table 2 Orthogonal test design and intuitive analysis results

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis results

根據表2和表3可以看出，各因素對多糖脫色效果的影響順序為溫度（B）＞pH（D）＞雙氧水加入量（A）＞時間（C）。FB=16.19＞F0.01（2，8）=8.65，說明溫度影響極顯著；FD=11.59＞F0.01（2，8）=8.65，說明pH值影響極顯著；F0.05（2，8）=4.46＜FA=7.85＜F0.01（2，8）=8.65，雙氧水加入量影響顯著；FC=0.76 ＜ F0.05（2，8）=4.46，時間對試驗結果影響不顯著。通過正交試驗最終確定最優工藝為A3B3C2D3，即溫度為70℃，雙氧水體積分數為15%，調節pH值為9的條件下脫色4 h。

2.4 驗證試驗結果

在A3B3C2D3最佳工藝條件下進行5組驗證試驗（表4），結果顯示平均脫色率為（88.00±0.45）%，多糖平均保留率為（71.32±0.67）%，綜合評分為79.66±0.32，高于正交試驗綜合評分中所有組別，因此確定該條件為平臥菊三七多糖GPP-20雙氧水脫色法的最佳工藝。

表4 驗證試驗結果（n=5）Table 4 The verification experiment result（n=5）

3 結論

本研究通過單因素試驗，分別考察雙氧水加入量、脫色溫度、脫色時間、pH值4個主要因素對平臥菊三七多糖GPP-20脫色效果的影響，并進一步采用L9（34）正交試驗優化其最佳脫色工藝。結果表明在溫度為70℃，雙氧水體積分數15%，pH值為9的條件下脫色4 h，GPP-20的脫色效果較好，綜合評分達到（79.66±0.32）。

與活性炭和大孔樹脂法相比，雙氧水氧化法具有操作簡單、成本低、容易清除等優點[21]，因此天然多糖脫除色素經常采用后者[22-23]。然而試驗發現溶液中殘留的雙氧水會對苯酚-硫酸法造成不良影響，使反應液顏色呈現綠色而無法繼續在490 nm處測定糖含量（正常為橙色），因此脫色反應結束時必須首先除去雙氧水，再進行顯色反應。本試驗選取二氧化錳固體催化劑，既能迅速分解雙氧水又能簡單去除。至于雙氧水對多糖結構產生的影響及機理，則需要進一步探索研究。