陽荷揮發油提取工藝優化及GC-MS分析

蔡依，徐津林，郭百臻，李肖，段金輝，阮金蘭，*

（1.武昌理工學院生命科學學院，湖北武漢430223；2.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北武漢430073）

陽荷系姜科姜屬多年生草本植物（Zingiber striolatum Diels），廣泛分布四川、貴州、廣西、湖北、湖南、江西、廣東等地[1]；生于林蔭下、溪邊，海拔300 m～1 900 m。陽荷是野生蔬菜，一年種植多年生長，能經受較惡劣的環境磨煉，生命力極強，基本上無病蟲害，無須使用農藥，且多地均有栽培。陽荷[2]是食藥同源，嫩芽、莖果味道香甜，可直接烹飪食用，富含有豐富的膳食纖維、必需氨基酸和蛋白質等，具有活血、化瘀、降血糖、治療痛經[3]等作用。現階段，國內外對陽荷的研究主要集中在膳食纖維、紅色素、多糖和降血糖等方面[4-6]，對陽荷揮發油相關的報道甚少。揮發油[7]又稱精油，是天然植物的活性成分之一，具有分子量小，可隨水蒸氣蒸出等特點，其化學成分復雜，具有抗炎、抗過敏、抗氧化、抑菌和抗腫瘤等作用[8-9]。作者課題組前期研究發現陽荷提取物能明顯地降低糖尿病實驗動物的血糖，極具深入研究價值，本試驗采用單因素試驗、多因素多水平的正交試驗、超聲輔助蒸餾法提取陽荷揮發油[10]并優化陽荷揮發油的提取工藝，氣相色譜-質譜（gass chromatography-mass spectormetry，GC-MS） 分析陽荷揮發油的化學成分，以期為陽荷的深入研究與開發，充分發掘陽荷資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陽荷：湖北省恩施利川現代農業公司，經本課題組阮金蘭教授鑒定為陽荷Zingiber striolatum Diels。

無水乙醚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A-5975C型氣質聯用儀：美國Agilent公司；ZNHW型電熱套：上海越眾儀器設備有限公司；TQ10超純水機：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發油的提取

提取方法[11]：本試驗采用超聲輔助蒸餾提取法提取陽荷揮發油，并計算揮發油的提取率，提取率/%=揮發油重量（g）/陽荷重量（g）×100。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 超聲時間的考察

準確稱取100 g打漿后的陽荷5份，以1∶2.5（g/mL）的料液比加入純化水，攪拌均勻，分別超聲30、40、50、60、70 min，然后蒸餾提取3 h，收集蒸餾液，分別用無水乙醚萃取揮發油，回收乙醚完全以后計算提取率。

1.3.2.2 蒸餾時間的考察[12]

準確稱取100 g打漿后的陽荷5份，以1∶2.5（g/mL）的料液比加入純化水，攪拌均勻，用1.3.2.1中的最佳超聲時間超聲，分別蒸餾 1、2、3、4、5 h，收集蒸餾液，分別用無水乙醚萃取揮發油，回收乙醚完全以后計算提取率。

1.3.2.3 料液比的考察

準確稱取100 g打漿后的陽荷5份，分別以1∶1.5、1 ∶2、1 ∶2.5、1 ∶3、1 ∶3.5（g/mL）的料液比加入純化水，以1.3.2.1中的最佳超聲時間超聲，用1.3.2.2中的最佳蒸餾時間蒸餾提取，收集蒸餾液，分別用無水乙醚萃取揮發油，回收乙醚完全以后計算提取率。

1.3.3 正交試驗[13]

在1.3.2中的單因素試驗的基礎上，選取提取時間、料液比及超聲時間3個影響因素，以揮發油提取率為評價指標，采用三因素三水平的正交試驗方法進行正交試驗，并進行比較試驗，確定最佳提取工藝。

1.3.4 驗證試驗[14]

為保證工藝的重復性和可行性，對最佳提取工藝進行驗證試驗，以陽荷揮發油提取率為評價指標，并計算RSD值。

1.3.5 GC-MS分析[15-17]

色譜條件：DB-5MS色譜柱（0.24 mm×30 m，0.25 μm），載氣為氦氣，進樣口溫度為250℃，流速為1.0 mL/min，程序升溫，進樣量為0.2 μL。質譜條件：電離方式為EI，電子能量為70 eV，離子源溫度260℃，接口溫度為260℃，全掃描采集，掃描范圍m/z40～600。質譜數據庫為NIST4.0。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間對陽荷揮發油提取率的影響

超聲時間對陽荷揮發油提取率的影響見圖1。

圖1 超聲時間對陽荷揮發油提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

如圖1所示，隨著超聲時間的增加，陽荷揮發油的提取率逐漸升高，在超聲60 min時達到峰值，提取率達到0.031 2%，超聲時間超過60 min后揮發油提取率開始下降。因此，確定較佳超聲時間為60 min。

2.1.2 蒸餾時間對陽荷揮發油提取率的影響

蒸餾時間對陽荷揮發油提取率的影響見圖2。

圖2 蒸餾時間對陽荷揮發油提取率的影響Fig.2 Influence of distillation time on the extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

如圖2所示，隨著蒸餾時間的增加，陽荷揮發油的提取率逐漸升高，在蒸餾4 h時達到峰值，提取率達到0.027 6%，蒸餾時間超過4 h后揮發油提取率開始下。因此，確定較佳蒸餾時間為4 h。

2.1.3 料液比對陽荷揮發油提取率的影響

料液比對陽荷揮發油提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對陽荷揮發油提取率的影響Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

如圖3所示，隨著料液比的增加，提取率逐漸升高，在1∶3（g/mL）時達到峰值，陽荷揮發油提取率達到0.026 6%，在1∶3.5（g/mL）后提取率開始下降。因此，較佳料液比為 1 ∶3（g/mL）。

2.2 正交試驗結果

正交因素水平表的設計：根據單因素試驗結果，設計L9（33）表，以陽荷揮發油的提取率為綜合評價指標，因素水平安排見表1，正交試驗結果見表2和表3。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance in orthogonal experiments

對上述正交試驗結果進行直觀分析和方差分析，K值越大表示該水平對提取率的影響越大，影響陽荷揮發油提取率的主次因素為A＞C＞B，即超聲時間＞料液比＞蒸餾時間。通過比較K值，選擇K值最大的因素水平即為最佳提取工藝，最佳提取方案是A3B2C2。

依據正交試驗結果，依次對A、B、C 3個因素進行方差分析[18]，分別計算離差平方和、自由度、均方、F和P。由表3分析可知，因素A對陽荷揮發油的提取率有決定性影響，因素B和因素C對陽荷揮發油的提取率均無顯著性影響。

2.3 比較試驗

將最佳提取工藝A3B2C2，與正交表中第8組A3B2C1進行比較試驗，結果見表4。

表4 比較試驗Table 4 Comparison experiments

正交表優選方案A3B2C2提取率高于正交表中第8組A3B2C1的提取率，因此最佳提取方案是A3B2C2，超聲 60 min，蒸餾時間 4 h，料液比為 1 ∶3（g/mL）。

2.4 驗證試驗

以正交試驗的最優化方案A3B2C2提取陽荷揮發油，重復3次，結果如表5所示。

表5 驗證試驗Table 5 Validation experiment

圖4 陽荷揮發油總離子流色譜Fig.4 Total ion chromatogram of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

表6 陽荷揮發油成分及相對含量Table 6 Composition and relative content of the volatile oil of the Zingiber striolatum Diels

陽荷揮發油提取率分別為0.036 8%、0.036 4%和0.035 9%，RSD值等于1.23%，證明優選工藝穩定可行，重復性好。

2.5 陽荷揮發油化學成分分析

采用GC-MS技術對陽荷揮發油進行成分分析，獲得總離子流色譜圖，見圖4。從陽荷揮發油中鑒定出17種物質，結果見表6。

所得揮發油大多為烯烴類組分，其中含量較高的有棕櫚酸（30.508%）、β-水芹烯（12.359%）、芥酸酰胺（7.376%）、α-律草烯（6.501%）、正十七烷（4.830%）、亞油酸（4.147%）、亞麻酸甲酯（3.242%）、β-蒎烯（3.065%）、4-（1-甲基乙基）-2-環己烯-1-酮（2.196%）。

王軍民等[19]采用水蒸氣蒸餾法提取陽荷揮發油，提取率高達2.605%，共鑒定出55個化學成分，占化合物總數的93%，含量較高的有檸檬烯（26.695%）、α-蒎烯（3.683%）、β-蒎烯（4.292%）、α-石竹烯（5.328%）等，與本試驗的陽荷揮發油提取率和揮發油成分差異較大。王軍民等所使用的陽荷采自云南省西疇縣，本試驗所使用的陽荷采自湖北恩施。王軍民等采用單一水蒸氣蒸餾法、石油醚萃取揮發油，本試驗采用超聲輔助蒸餾提取法、無水乙醚萃取。后期本課題組將購買云南省西疇縣所產陽荷，通過試驗比較不同產地、提取方法、萃取溶劑對陽荷揮發油、化學成分的影響。

3 結論

揮發油是陽荷的主要化學成分類別之一，具有廣泛的生理活性，隨著天然植物現代化的深入開展，揮發油的成分分析成為熱點之一。本試驗通過單因素試驗和多因素多水平的正交試驗對陽荷揮發油的提取工藝進行了研究。應用GC-MS技術分析了陽荷揮發油的主要化學成分，得到了最佳提取工藝為：超聲60 min，蒸餾時間 4 h，料液比為 1 ∶3（g/mL）。在此提取條件下陽荷揮發油提取率可達到0.036 8%，提取方法可行，具有簡單快捷的特點。通過GC-MS數據庫共鑒定出所得揮發油中17個主要化學成分，其中8個是烯烴類化合物，棕櫚酸含量高達30.508%。本試驗優化了陽荷揮發油的提取工藝，采用GC-MS技術分析了陽荷揮發油主要成分，為陽荷資源合理開發提供了科學試驗依據。