響應面優化西蘭花莖硫苷提取及其抗氧化性研究

（長沙商貿旅游職業技術學院湘菜學院，湖南長沙410116）

西蘭花（Brassica oleracea L.var.Italic Planch）又名綠花菜、花椰菜、青花菜等，屬十字花科蕓苔屬甘藍種的一個變種。流行病學研究表明，隨著十字花科蔬菜食用量的增加，多種癌癥的發生率隨之降低，其中以西蘭花和卷心菜最為顯著。Verhoeven等[1]通過研究發現70%的癌癥與十字花科蔬菜的攝入量呈負相關。食用十字花科蔬菜能降低人類前列腺癌、肺癌、食道癌、膀胱癌和結腸癌等患病風險[2-3]。多項研究表明十字花科蔬菜及其某些成分具有抗癌作用，其中包括硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷glucosinolates，GS）、吲哚類、吡噻硫酮等。而西蘭花種苗中硫代葡萄糖苷類含量十分豐富，其對健康促進作用通常主要歸功于其次生代謝產物水解產生的異硫氰酸酯（isothiocyanate，ITCs），完整的硫代葡萄糖苷幾乎沒有抗癌活性，只有在水解成異硫氰酸酯后才能發揮其重要的抗癌防癌作用[4]。

西蘭花是十字花科主要的作物之一，然而在生產鏈的不同階段產生了大量西蘭花邊角廢料和副產品，產生的副產物葉和莖大約占西蘭花的總重量的40%～50%左右[5-7]。目前，關于直接通過酶解西蘭花或從油菜籽等中提取ITCs的國內外研究比較多[8-9]，而關于從西蘭花莖中提取GS的研究報道比較少[10-11]；GS在內源性芥子酶等作用下水解成ITCs產生刺激性氣味，盡管ITCs具有很好的抗癌等功能，但其不愉快的氣味對產品感官產生很大負面影響，直接添加在產品中ITCs成分消費者難以接受[12]；然而研究表明人體的腸道菌群能夠水解GS產生ITCs，從而避免了直接添加ITCs造成產品感官的缺陷[13-14]。

本試驗以西蘭花莖為原料，通過超聲波輔助提取GS[15]，采用氯化鈀分光光度法測定硫苷的含量，通過單因素研究超聲功率、提取時間、物料粒徑、料液比以及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）濃度等因素對GS的提取率的影響，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，以硫苷提取量為響應指標，采用四因素三水平響應面分析方法確定GS的最優提取工藝條件；以市售蘋果汁為載體測定粗提硫苷的體外抗氧化活性，以期為西蘭花綜合利用提供科學依據。

1 試驗材料和設備

1.1 試驗材料和試劑

新鮮西蘭花副產物（莖）、蘋果汁：市售；鹽酸、氯化鈀、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）：南京化工廠。

1.2 試驗儀器

HH恒溫水浴鍋：金壇市中大儀器廠；VGT-1860QTD單槽超聲波清洗機：廣東固特超聲股份有限公司；FA2004N電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TG16臺式離心機：長沙英泰儀器有限公司；TYL-2AB不銹鋼電熱鼓風干燥箱：天津天有利科技有限公司。

2 方法

2.1 預處理

將新鮮的西蘭花莖洗凈，用刀切成薄片（0.1 cm～0.3 cm）后迅速在90℃熱燙5 min進行滅酶處理。將滅酶后得西蘭花薄片在60℃下恒溫干燥后粉碎過60目篩得到西蘭花莖粉末（broccoli stems powder，BSP）備用。

2.2 西蘭花莖中提取硫苷的單因素試驗

選擇超聲提取時間、超聲提取功率、超聲提取溫度、料液比以及PBS濃度為研究變量，考察超聲提取時間、超聲提取功率、超聲提取溫度、料液比以及PBS濃度對西蘭花莖硫苷提取產率的影響。

2.3 響應面分析試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，選取超聲功率、超聲時間、提取溫度和料液比4個影響最為顯著的因素為自變量，采用四因素三水平的響應面試驗設計，見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

2.4 西蘭花莖硫苷的測定方法

2.4.1 標準曲線

采用氯化鈀分光光度法測定硫苷的含量[16]，測得標準曲線：

式中：y為待測液在 540 nm 處的吸光度（A540）；x為待測液的硫苷含量，mg/mL。

硫甙含量與A540呈線性正相關，因此本試驗用A540表示提取液中硫甙含量。

2.4.2 樣品硫苷含量測定

取上清濾液1 mL置于試管中，加入2 mL0.15%CMC-Na溶液搖勻后，加入1 mL8 mmol/L氯化鈀顯色液充分搖勻，在25℃下恒溫放置2小時后在540 nm下測定吸光度。

2.5 西蘭花莖硫苷的抗氧化能力測定

根據Biegańskamarecik等[17]ABTS法測定自由基清除活性。將0.007 mol/L ABTS溶液與0.002 mol/L過硫酸鉀溶液以1∶0.5（體積比）混合在室溫下避光放置12 h～16 h。測定前，將ABTS溶液用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋直到 ABTS 溶液達到 0.700（±0.020）的吸光度。將提取上清液（50 μL）與5 mL稀釋的ABTS溶液混合，37℃下反應5分鐘后在734 nm測定其吸光度A734，以PBS緩沖液用作空白。平行測定3次，根據以下公式算ABTS+·的清除率，結果用μmol/mL Trolox相對值表示。

式中：A為樣品吸光值；A0為空白吸光值。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 超聲功率對硫苷提取量的影響

超聲功率對硫苷提取量的影響見圖1。

圖1 超聲功率對硫苷提取的影響Fig.1 The effect of ultrasonic power on the extraction volume of GS

由圖1可知，超聲功率由30 W升到90 W過程中，硫苷含量不斷增大，在90 W時吸光值達到最大，為0.650（GS含量為0.641 mg/mL），當超聲功率繼續增大時，硫苷含量開始下降，原因是超聲功率的增大使得硫苷水解成ITCs等物質[18]；由于在60 W和90 W測得的吸光度值無顯著差異（n=3，p＞0.05），考慮節約能源與工業化生產經濟可行性等因素條件下選取最佳超聲功率為60 W。

3.1.2 超聲時間對硫苷提取量的影響

超聲時間對硫苷提取量的影響見圖2。

由圖2可知，超聲時間由10 min到20 min過程中，硫苷含量不斷增大，在20 min時吸光值達到最大，為0.602（GS含量為0.589 2 mg/mL），當進一步延長超聲時間，硫苷含量開始下降，這是由于超聲作用有助于硫苷水解成ITCs[18]。因此選擇最佳超聲時間為20 min。

圖2 超聲時間對硫苷提取的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extraction volume of GS

3.1.3 提取溫度對硫苷提取量的影響

提取溫度對硫苷提取量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對硫苷提取的影響Fig.3 The effect of extraction temperaure on the extraction volume of GS

由圖3可知，當提取溫度由20℃升到60℃時，硫苷含量先升后降，在40℃時吸光值達到最大，為0.632（GS含量為0.622 mg/mL），當溫度繼續升高時，硫苷含量開始下降，這是由于硫苷受熱不穩定，高溫下易水解成ITCs等物質[19]；試驗結果表明低溫條件下有利于硫苷的穩定存在，因此，選取最佳提取溫度為40℃。

3.1.4 料液比對硫苷提取量的影響

料液比對硫苷提取量的影響見圖4。

由圖4可知，當料液比逐漸增大時，硫苷含量先增大后趨于水平，當料液比由1∶5（g/mL）增大到1∶15（g/mL）時，吸光值逐漸升高，硫苷充分溶出；當料液比由 1∶15（g/mL）增大到 1∶25（g/mL）時，吸光值趨于水平，這是由于硫苷溶出率趨于飽和。當料液比為1∶20（g/mL）時，吸光值達到最大，為0.567（GS含量為 0.506 mg/mL），由于料液比為 1∶15（g/mL）和1∶20（g/mL）的吸光值在統計學上無顯著性（p＞0.05），因此，選取最佳料液比為1∶15（g/mL）。

圖4 料液比對硫苷提取的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction volume of GS

3.1.5 PBS濃度對硫苷提取量的影響

PBS濃度對硫苷提取量的影響見圖5。

圖5 PBS濃度對硫苷提取的影響Fig.5 The effect of PBS buffer concentration on the extraction volume of GS

由圖5可知，當PBS濃度逐漸增大時，硫苷含量先增大后逐漸減小，當PBS濃度為0.6 mol/L時，吸光值達到最大，為0.612（GS含量為0.600 mg/mL）。由于0.4 mol/L和0.6 mol/L的吸光值在統計學上無顯著性（p＞0.05），因此，考慮節約能源與工業化生產經濟可行性等因素條件下選取最佳PBS濃度為0.4 mol/L。

3.2 響應面法優化硫苷提取工藝

采用Design-Expert 8.0.6對試驗數據進行回歸分析，擬合二次多項式方程，用R2表示擬合度；采用F檢驗對響應面試驗數據進行方差分析以評價模型的統計學意義。

3.2.1 Box-Behnken設計方案及試驗結果

根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，依據單因素試驗結果，結合最小顯著性差異分析，選取超聲時間、超聲功率、提取溫度和料液比4個條件作為主要因素，以硫苷濃度（mg/mL）為響應值。依據Design-Expert 8.0.6軟件設計試驗方案，結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及試驗數據結果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

3.2.2 模型建立及方差分析

運用Design-Expert 8.0.6對表2的試驗數據進行多元回歸分析，得到以硫苷含量（Y）為響應值的擬合方程：

回歸方程的方差分析結果見表3。

由表3可知，超聲時間（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C）、超聲時間和超聲功率的交互項（AB）、超聲時間二次項（A2）、超聲功率二次項（B2）、提取溫度二次項（C2）和料液比二次項（D2）達到極顯著水平（p＜0.01）；超聲時間和提取溫度交互項（AC）與提取溫度和料液比交互項（CD）達到顯著水平（p＜0.05）。這說明選取的試驗因素對響應值的不是簡單的線性關系，還能看出各因素對硫苷含量的影響大小順序：C＞B＞A＞D。

表3 響應面二次回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

圖6 超聲功率和超聲時間交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and ultrasonic treatment time

該模型的 R2值為 0.977 6（p＜0.01），虛擬項不顯著（p=0.070 8），說明通過二次回歸得到的硫苷含量模型與試驗擬合度良好、誤差小；模型的校正系數RAdj2=0.955 2，表明此回歸模型可以解釋95.52%響應值變化，說明此法可靠、具有可行性。

通過軟件分析得出最佳提取條件為：超聲時間22.42 min、超聲功率79.59 W、提取溫度37.96℃、料液比1∶16.56（g/mL），在此條件下硫苷提取量的預測值為0.740 mg/mL。基于工業化實際可操作性等因素考慮，將最佳提工藝條件調整為：超聲時間22 min、超聲功率80W、提取溫度 40℃、料液比 1∶16（g/mL），在此條件下進行3次平行試驗，提取的硫苷含量為0.732 mg/mL，與理論值相對誤差為1.1%，說明試驗結果與模型符合良好。

3.2.3 因子交互作用分析

應用Design-Expert 8.0.6軟件分析因素交互作用響應面及等高線圖（見圖6～圖11），通過該組動態圖即可對任何兩個因素交互影響提取西蘭花莖硫苷含量的效應進行分析與評價。所擬合的響應曲面和等高線圖能較直觀地反映各因素間的交互作用對響應值的影響，其中等高線呈圓形說明兩個因素交互作用不顯著，等高線呈橢圓說明兩個因素交互作用顯著。

圖8 料液比和超聲時間交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus solid-liquid ratio and ultrasonic treatment time

圖9 提取溫度和超聲功率交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and extraction temperature

圖10 超聲功率和料液比交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and solid-liquid ratio

圖11 提取溫度和料液比交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus extraction temperature and solid-liquid ratio

由圖6～圖11可以看出，每個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，每個響應面都有極高值，出現在等高線的圓心處。其中超聲時間（A）和料液比（D）的等高線圖與圓形最接近，說明他們之間的交互作用對硫苷含量提取的影響最小，其次是超聲功率（B）和超聲溫度（C）、超聲功率（B）和料液比（D）。而等高線越扁平則表示兩因素的交互作用越大，超聲時間（A）和超聲功率（B）的交互作用對硫苷提取量的影響作用最大。

3.3 西蘭花莖硫苷的抗氧化結果分析

以最優工藝組合對西蘭花莖進行提取，以100 mL市售蘋果汁為載體，蘋果汁添加西蘭花莖提取物的抗氧化結果見表4。

表4 西蘭花莖提取物的抗氧化結果（n=5，平均值±標準偏差）Table 4 The antioxidant activity result of extracts from broccoli stems（n=5，average value ± standard deviation）

西蘭花莖提取物抗氧化結果見表4，與原蘋果汁抗氧化能力4.08 μmol Trolox/mL相比，通過添加西蘭花莖提取物能顯著提高蘋果汁的抗氧化能力（p＜0.05）；添加西蘭花莖提取原液使得蘋果汁的抗氧化能力提升62.99%，而添加西蘭花莖提取液的凍干物使得蘋果汁的抗氧化能力提升了124.51%。

4 結論

本研究對超聲輔助提取西蘭花莖中硫代葡萄糖苷的各個相關因素進行了研究，在單因素試驗的基礎上，對超聲輔助法提取西蘭花莖中硫代葡萄糖苷的提取條件進行了響應面優化，并通過驗證試驗得到了最佳超聲輔助提取西蘭花莖中硫代葡萄糖苷的工藝條件，即超聲時間22 min、超聲功率80 W、提取溫度40℃、料液比1∶16（g/mL），從西蘭花莖中提取的硫苷總含量為0.732 mg/mL。在現有的研究基礎上，初步探討了與硫代葡萄糖苷相關的4個不同因素對硫苷提取量的影響，對提取物的抗氧化性進行分析，結果顯示在添加提取原液和凍干物兩種形式的西蘭花莖提取物，抗氧化值由原來的4.08 μmol Trolox/mL分別提高到6.65 μmol Trolox/mL 和 9.16 μmol Trolox/mL，平均提高了2倍～3倍，并達到了預期效果，試驗結果為從天然材料中提取硫代葡萄糖苷的工業化生產提供理論依據。