高效液相色譜法檢測大米中11種熒光增白劑

何海彤，黃楚雯，伍志航

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東佛山528300）

熒光增白劑 （fluorescent whitening agents，FWAs）是一種無色的熒光染料[1]，俗稱“白色”染料[2]，也是一種復雜的有機化合物。最初的熒光增白劑廣泛用于紡織品、造紙、涂料、洗滌用品和塑料制品等多個領域，既可以提高基質的白度，也可以保證基質的亮度[3]。隨著熒光增白劑的使用越來越普及，某些不法商家為了商品的增白效果和獲取更多的利益，向食品包裝中違規加入熒光增白劑，使食品接觸性材料領域中熒光增白劑安全問題不斷涌現。據報道，2011年上半年，北京、上海、西安、廣州等地的影院所使用的爆米花桶就檢出過存在非法添加熒光增白劑的案例[4]。不法商家也可能為了掩蓋食品發黃或霉變的事實，往食品中直接添加熒光增白劑，達到增白的效益。甚至商家為了使食品包裝材料增白增亮而使用熒光增白劑，而熒光增白劑通過遷移污染食品內容物，從而導致食品中可能含有熒光增白劑。國內有報道證實稱鮮豬皮、鮮蘑菇等食品中直接或間接人為地受到熒光增白劑的污染[5]。隨著媒體的頻繁曝光，大眾對食品及接觸性材料安全性的關注度不斷提高。然而熒光增白劑在使用安全性上存在一些爭議[3，6]，醫學臨床實驗證明，熒光增白劑和皮膚蛋白質結合力很強，不易洗去，結合后會對皮膚產生刺激，導致過敏或發炎等癥狀[7]，一旦熒光增白劑在人體內蓄積，就會存在削弱人體免疫力及傷口愈合能力、危害肝臟等其他重要器官的風險，甚至有可能誘發細胞癌變[8]。美國[9]、中國[10]等國家及歐盟[11]都將熒光增白劑作為食品接觸性塑料制品的添加劑進行監管，規定了相關的限用量和/或特定的遷移量，制訂了相關的檢測標準。食品接觸性材料的檢測方法日趨成熟，此前已有大量報道，但至今為止只有少數研究如食用菌[12-13]、面粉[14]、食用油[15]以及自制食品模擬物[16]建立食品中可能含有熒光增白劑的檢測方法。因此本試驗建立大米中熒光增白劑的檢測方法可以為食品安全問題的風險控制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：市售。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國TEDIA公司；四丁基溴化銨（tetrabutyl ammonium bromide，TBA，分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司。

11種熒光增白劑標準品：FWA5bm（98μg/mL）、C.I85（101 μg/mL）、C.I 113（108 μg/mL）、C.I 71（146 μg/mL）、C.I 90（111 μg/mL）、C.I 24（100 μg/mL）、C.I 210（102 μg/mL）、C.I 220（101 μg/mL）、C.I 264（112 μg/mL）、C.I 357（104 μg/mL）、C.I 353（103 μg/mL）：福州綠川生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）：日本島津SHIMADZU公司；ML204/02萬分之一電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；3-3KS高速冷凍離心機：美國Sigma公司；Milli-Q去離子水發生器：美國Millipore公司；MS3漩渦混合器：德國IKA公司；JP-C400超聲波清洗器：廣州市吉普超聲波電子設備有限公司；CM200-2氮吹濃縮儀：北京成萌偉業科技有限公司；移液管（1 mL）：天津玻璃儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

10 μg/mL混合標準品使用液1：分別準確移取適量體積的C.I 220，C.I 210，C.I 85，C.I 357，C.I 90，FWA5bm標準品儲備液于10 mL棕色容量瓶中，40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）定容。標準品色譜圖見圖1。

圖1 混合標準品1的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard substance 1

10 μg/mL混合標準品使用液2：分別準確移取適量體積的 C.I 24，C.I 264，C.I 353，C.I 71 標準品儲備液于10 mL棕色容量瓶中，40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）定容。標準品色譜圖見圖2。

圖2 混合標準品2的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard substance 2

10 μg/mL標準品使用液3：準確移取適量體積的C.I 113標準品儲備液于10 mL棕色容量瓶中，40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）定容。標準品色譜圖見圖3。

圖3 標準品3的色譜圖Fig.3 Chromatogram of standard substance 3

用40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）將3 個標準品使用液分別逐級稀釋為 0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、8、10 μg/mL 的系列標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

精確稱取1 g（精確至0.001 g）大米樣品于50 mL具塞離心管中，加入1 mL 40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）漩渦提取30 s，8 000 r/min下離心2 min，取上清液，重復以上步驟再提取1次，合并上清液，30℃下氮吹濃縮至近干，加入1 mL40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）溶解定容，漩渦30 s，超聲10 s，過0.45 μm有機濾膜，棄去初濾液，取續濾液，待測。試驗過程全程避光操作。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（5 μm，4.6×250 mm）；流動相（A）：乙腈 ∶甲醇（2∶3，體積比）；流動相（B）：含25 m mol TBA的甲醇-水（5∶95，體積比，三乙胺調pH值至 8.0）；柱溫：35 ℃；檢測波長：350 nm；進樣量：20 μL；流動相與梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相與梯度洗脫條件Table 1 Gradient program of the mobile phase

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取條件的優化

對不同提取條件進行比對，包括提取溶劑及提取次數。自制陽性樣品的對比結果見表2和表3。

表2 不同提取溶劑對11種熒光增白劑回收率的影響（n=6）Table 2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）

表3 不同提取次數對11種熒光增白劑回收率的影響（n=6）Table 3 Effect of different extraction times on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）

從表2中可以看出，40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）作為提取溶劑時，自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率為87.7%～102.0%，明顯優于其他提取溶劑，其他提取溶劑的回收率均低于80.0%；從表3中可以看出，提取2次時，自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率為86.5%～101.6%，明顯優于提取1次時的回收率，提取1次的回收率均低于84.0%。因此，本試驗確定的提取條件為40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）作為提取溶劑，提取次數為2。

2.1.2 氮吹條件的優化

對不同氮吹條件進行比對，包括氮吹溫度及程度。自制陽性樣品的對比結果見表4和表5。

從表4中可以看出，氮吹溫度為30℃時，自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率為73.9%～101.6%，優于其他氮吹溫度，其他氮吹溫度下部分待測物的回收率低于60.0%；從表5中可以看出，氮吹至近干時，自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率為78.2%～103.3%，優于氮吹至干，氮吹至干后部分待測物的回收率低于60.0%。因此，本試驗確定的氮吹條件為在30℃下氮吹至近干。

表4 不同氮吹溫度對11種熒光增白劑回收率的影響（n=6）Table 4 Effect of different nitrogen blowing temperatures on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）

表5 不同氮吹程度對11種熒光增白劑回收率的影響（n=6）Table 5 Effect of different nitrogen blowing degrees on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）

2.1.3 氮吹后定容溶劑的優化

對氮吹后不同定容溶劑進行比對，自制陽性樣品的對比結果見表6。

從表6中可以看出，不同的定容溶劑對于自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率影響相差較大，40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）作為氮吹后定容溶劑時，自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率為77.7%～98.7%，明顯優于其他的溶劑，其他定容溶劑的回收率均低于55.0%。因此，本試驗確定的氮吹后定容溶劑為40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至 11.5）。

表6 不同定容溶劑對11種熒光增白劑回收率的影響（n=6）Table 6 Effect of different constant volume solvents on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）

2.1.4 初濾液取舍的優化

本研究對上機檢測前的初濾液取舍進行比對，自制陽性樣品的對比結果見表7。

從表7中可以看出，上機檢測前是否棄去初濾液對于自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率影響相差較大，棄去初濾液后上機檢測，自制陽性樣品中11種熒光增白劑的回收率為78.2%～99.9%，各待測物的回收率均高于保留全部濾液時的回收率。因此，本試驗確定在上機檢測前的過濾需棄去初濾液，取續濾液。

2.2 線性關系、相關系數和檢出限

11種熒光增白劑的線性范圍均為0.1 μg/mL～10 μg/mL。自制陽性樣品在優化的條件下，根據試驗方法處理，上機根據S/N＞3確定方法的檢出限（limit of detection，LOD），以待測物的峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X，μg/mL）繪制標準曲線。本方法的線性方程、相關系數及檢出限見表8。

表8 11種熒光增白劑的線性方程、相關系數及檢出限Table 8 Regression equations，correlation coefficients and LODs of 11 kinds of fluorescent whitening agent

結果表明，11種熒光增白劑在各自線性范圍內線性關系良好，相關系數R2均大于0.999 9。該方法線性關系良好，靈敏度高。

2.3 回收率和精密度

在陰性樣品中加入標準物質，進行添加水平為0.5、0.8、1.0 μg/mL的加標回收率試驗，每個添加水平重復6次，11種熒光增白劑的回收率和精密度具體結果見表9。

表9 大米中11種熒光增白劑的回收率和精密度（n=6）Table 9 Recoveries and RSDs of 11 kinds of fluorescent whitening agent in rice（n=6）

3個添加水平的平均回收率為59.3%～89.0%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 1.1%～5.8%，表明方法具有良好的準確度和精密度。

2.4 實際樣品分析

從市場、超市、糧油店隨機購買20個不同品牌的大米，在優化后的條件下進行樣品處理和色譜分析檢測，結果發現這20個大米樣品中均未檢出這11種熒光增白劑。但由于大米品種眾多，且不排除樣品包裝材料中的熒光增白劑發生遷移，而大米又是我們平常必不可少的主食之一，因此，建立大米中熒光增白劑的檢測方法具有一定的意義。

3 結論

本研究建立高效液相色譜法檢測大米中11種熒光增白劑含量的分析方法：樣品經40%乙腈-水溶液（三乙胺調pH值至11.5）提取，氮吹濃縮，經C18柱分離，二極管陣列檢測器檢測，350 nm波長掃描，外標法定量。本方法簡單、快速、高效，可滿足日常檢測的需要，具有應用于大規模檢測的實際意義，能為大米中熒光增白劑的風險檢測提供有力的基礎。