一株產廣譜細菌素乳酸菌的篩選與鑒定

趙天宇，郭一柯，劉霽逸，龐茂達

（1.金陵中學，江蘇南京210005；2.江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，江蘇南京210014；3.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇南京210014）

細菌素（bacteriocin）是某些細菌由核糖體途徑合成的具有抗菌活性的多肽或蛋白質。大多數細菌素具有高效、無毒、無抗藥性、無副作用、無殘留、熱穩定好、不影響食品風味等優點。由于乳酸菌是“公認安全”的菌株，使得乳酸菌細菌素在食品保鮮上的應用受到廣泛關注[1]。越來越多的研究表明，乳酸菌及其代謝產物細菌素對奶制品、面包、肉制品、水產品等多種食品均有良好的保鮮效果[2]。乳酸鏈球菌素（nisin）是目前研究最多的乳酸菌細菌素，在50多個國家和地區廣泛應用于食品工業[3]。此外，促腸活動素AS-48、米酒乳桿菌素P、植物乳桿菌素163等細菌素也因能抑制腐敗菌和食源性致病菌等微生物的生長，顯示出很好的應用潛力[4-6]。但是目前商品化的細菌素防腐劑仍然較少，Nisin是被美國食品藥品監督管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）認可的唯一作為食品防腐劑的細菌素，也是我國批準使用的唯一細菌素防腐劑[7]。在歐洲，商品化的細菌素也只有尼爾斯克公司（Danisco）的Nisin和奎斯特公司（Quest）生產的片球菌素PA-1[8]。

已報道的細菌素大多數抗菌譜較窄，對革蘭氏陰性菌抑菌效果較差，這大大限制了其在食品工業中的應用。因此，篩選廣譜高效的細菌素具有更廣闊的應用前景，已成為現在關注的熱點。我國傳統發酵食品種類多樣，為研究人員篩選抑菌譜廣、抑菌活性強的細菌素產生菌提供了很好的條件。本文以不動桿菌、熱殺索絲菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，從傳統酸白菜中篩選出1株產廣譜細菌素的乳酸菌，通過傳統生理生化方法和分子生物學方法，對其進行菌種鑒定，并研究了細菌素部分生物學性質和抑菌譜，為乳酸菌細菌素的商業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

傳統酸白菜：沈陽裕豐腌菜廠。

1.2 指示菌

革蘭氏陽性菌：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）AS1.1846、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）CMCC 63202、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）ATCC 11509、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19114、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC 28000、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923。

革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、熒光假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）AS 1.2620、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）CICC 21527、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC 51005。

試驗所用菌株均為江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所畜產品污染監測及預防研究室保存。

1.3 試劑

MRS培養基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、K2HPO42.0 g/L、檸檬酸二銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、MgSO4·H2O0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、吐溫-80 1.0 mL，蒸餾水 1 L，調節 pH 值至6.2±0.2，7×104Pa滅菌 20 min；LB 培養基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物 5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、pH 7.0±0.2，1×105Pa滅菌 15 min；胰蛋白酶（2 500 units/mg）、蛋白酶 K（30 units/mg）、木瓜蛋白酶（2 400 units/mg）、胃蛋白酶（2 000 units/mg）；以上試劑均為國產分析純級，購自南京鼎思生物技術有限公司。

革蘭氏染色試劑盒：杭州百思生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒：美國Omega公司；Taq DNA聚合酶、GelExtractionKit：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 乳酸菌的分離純化

無菌鑷子取25 g酸菜樣品接種到含100 mL生理鹽水的三角瓶中，振蕩培養30 min。采用常規的稀釋涂布法分離乳酸菌。樣品用無菌生理鹽水10倍倍比稀釋，取 10-3、10-4、10-5梯度的樣品各 100 μL 涂布于MRS固體培養基，30℃培養48 h。隨機挑取不同的菌落，在MRS固體培養基上劃線培養，以得到形態單一的單菌落。

1.5 產細菌素乳酸菌的初篩

分離純化得到的乳酸菌在MRS中傳代培養2次，10 000×g離心10 min，收集發酵上清液。以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，通過瓊脂擴散法篩選具有抑菌活性的乳酸菌[9]。具體方法如下：取1 mL培養至對數期的指示菌，接種于100 mL冷卻至50℃左右的LB固體培養基，混勻后倒入直徑為20 cm的無菌平板，制成帶指示菌的固體培養基。用孔徑10 mm的打孔器打孔，每孔加入100 μL發酵上清液。37℃培養8 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。選取抑菌圈直徑大于13 mm的乳酸菌進行復篩。

1.6 產細菌素乳酸菌的復篩

以革蘭氏陽性菌如蠟樣芽孢桿菌、熱殺索絲菌，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、鮑氏不動桿菌為指示菌進一步篩選具有廣譜抗菌活性的菌株。選取初篩結果為陽性的菌株進行發酵。為了排除H2O2和有機酸的干擾，發酵后上清液用過氧化氫酶處理，并用5 mol/L NaOH將發酵上清的pH值調至5.5。抑菌平板用打孔器打孔，每孔加入100 μL發酵上清液。37℃培養8 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.7 乳酸菌的鑒定

根據形態學、生理生化特征以及分子生物學對細菌素產生菌株進行菌種鑒定。形態學鑒定是通過觀察培養基上生長的菌落形態和革蘭氏染色后的菌體特征進行；理化特性分析主要以過氧化氫酶試驗、生長溫度試驗和糖發酵試驗為主，試驗方法和結果分析參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[10]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[11]。分子生物學鑒定通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對菌株16S rRNA基因進行擴增。

16S rRNA基因擴增引物序列：上游AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游 GGTTACCTT GTTACGACTT，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應體系（50 μL）：2×PCR Mix 25 μL；10 μmol/L 上、下游引物各2 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 個循環；72℃10 min。PCR產物回收后測序，測序結果在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的GenBank序列數據庫進行 BLAST分析[12]。

1.8 細菌素性質的初步研究

1.8.1 細菌素的蛋白酶敏感性

將發酵上清分別用1.0 mg/mL的胰蛋白酶[pH 7.5，10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）]、蛋白酶 K（pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl）、木瓜蛋白酶（pH 7.5，10 mmol/L PBS）和胃蛋白酶（pH 2.0，0.1 mol/L HCl）進行處理，37℃溫育30 min后，100℃加熱5 min終止反應[13]。隨后將樣品調節至初始pH 3.8，測定抑菌活性，以未加入酶的發酵上清液作對照，指示菌為蠟樣芽孢桿菌。

1.8.2 細菌素的熱穩定性

菌株發酵上清液分別在60、80、100、121℃下處理30 min，冷卻后用瓊脂擴散法進行抑菌試驗。以未加熱的發酵上清液作為對照。

1.8.3 細菌素的pH值穩定性

用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調節發酵上清液pH值為2～8，37℃靜置30 min，用瓊脂擴散法進行抑菌試驗。以未調節pH值的發酵上清（pH 3.8）為對照。

1.9 抑菌譜的測定

以蠟樣芽孢桿菌AS1.1846、短小芽孢桿菌CMCC 63202、熱殺索絲菌ATCC 11509、單增李斯特菌ATCC 19114、藤黃微球菌CMCC 28000、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌ATCC 25922、鮑氏不動桿菌、熒光假單胞菌AS 1.2620、腸炎沙門氏菌CICC 21527、鼠傷寒沙門氏菌CMCC 51005為指示菌，排除酸性物質的干擾后進行抑菌試驗，37℃靜置培養8 h，游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.10 數據處理與分析

試驗重復3次，數據用SPSS 21.0軟件進行處理分析，結果以平均數±標準差（M±SD）表示。用Graphpad Prism 7.0軟件繪制圖片。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離和篩選

采用瓊脂擴散法篩選產細菌素的乳酸菌，從208株分離得到的乳酸菌中初篩得到83株對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌有抑菌活性的乳酸菌。為排除H2O2和有機酸的干擾，復篩時在發酵上清液加入過氧化氫酶，并將pH值調節至5.5。復篩后得到5株對蠟樣芽孢桿菌、熱殺索絲菌、大腸桿菌和鮑氏不動桿菌均有抑菌效果的乳酸菌，從中挑選抑菌活性最好的5號菌株（命名為SY5）進行后續的研究。SY5對4種指示菌的抑菌圈大小見圖1。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

菌株SY5在MRS培養基上生長良好，呈乳白色、凸起、邊緣整齊、表面光滑的小菌落如圖2A。革蘭氏染色后鏡檢為藍紫色，無鞭毛和芽孢，顯示為革蘭氏陽性短桿菌如圖2B。

圖1 菌株SY5對4種指示菌的抑菌圈Fig.1 The inhibition zone sizes of strain SY5 against four indicator bacteria

圖2 菌株SY5的菌落形態和革蘭氏染色鏡檢圖Fig.2 Colony morphology and Gram staining of strain SY5

2.2.2 生理生化鑒定

菌株SY5過氧化氫酶陰性，能在15℃生長，不能在45℃生長，發酵葡萄糖但不產氣，這些特征說明SY5屬于同型發酵乳酸菌。糖發酵試驗結果如表1所示，菌株SY5發酵木糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、核糖、葡萄糖，不發酵阿拉伯糖和鼠李糖，根據伯杰氏細菌鑒定手冊，菌株SY5應屬戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。

表1 菌株SY5的糖發酵試驗結果Table 1 Results of sugar fermentation experiment of strain SY5

2.2.3 分子生物學鑒定

利用16S rRNA基因引物對菌株SY5基因組進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳得到一條1 500 bp左右的條帶見圖3。

圖3 16S rRNA基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Electrophoresis of PCR-amplified products of 16S rRNA gene

測序結果拼接后序列大小為1 428 bp，與NCBI數據庫中核酸數據進行比對，發現該菌株的16S rRNA基因與戊糖乳桿菌LBa相似性為100%。結合以上生理生化和分子生物學鑒定結果，確定該菌株為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。

2.3 乳酸菌細菌素性質分析

乳酸菌發酵上清液經蛋白酶作用后的抑菌效果見表2。

由表2可知，經胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后，戊糖乳桿菌SY5發酵上清抑菌效果明顯下降，特別是胃蛋白酶和蛋白酶K處理后使其完全失去抑菌活性，由此可見，戊糖乳桿菌SY5發酵上清的抑菌物質具有蛋白質的性質。由于試驗設計上排除了有機酸和過氧化氫等的干擾，可確定此抑菌物質是一種細菌素。

殘留的抑菌活性如表2所示，戊糖乳桿菌SY5上清液經不同溫度處理后，隨著作用溫度的升高，細菌素的抑菌活性有所下降，但在60℃30 min后，仍然保留90%以上的抑菌活性。121℃處理30 min后，也依然保留82.7%的抑菌活性，說明戊糖乳桿菌SY5產生的細菌素具有很好的熱穩定性。

戊糖乳桿菌SY5產生的細菌素pH穩定性如圖4所示。

圖4 細菌素的pH值穩定性Fig.4 pH stability of bacteriocin

該細菌素在pH＜4.0的酸性條件下有很好的抑菌活性；pH＞4.0以后，隨著pH值的增加，抑菌活性不斷減弱；pH＞8.0以后，抑菌活性基本消失。

2.4 抑菌譜的測定

戊糖乳桿菌SY5細菌素的抑菌譜見表3。

表3 戊糖乳桿菌SY5細菌素的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of Lactobacillus pentosus SY5 bacteriocin

如表3所示，戊糖乳桿菌SY5對革蘭氏陽性菌如蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、藤黃微球菌的有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑大于18 mm；對短小芽孢桿菌、熱殺索絲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鮑氏不動桿菌、腸炎沙門氏菌的抑菌效果相當，抑菌圈直徑在13 mm～17 mm；對熒光假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑菌圈小于13 mm。整體而言，戊糖乳桿菌SY5對革蘭氏陽性菌的抑制效果優于對革蘭氏陰性菌。

3 結論與討論

近年來，利用乳酸菌及其代謝產物細菌素對食品中腐敗菌和致病菌的抑制作用，來延長食品貯存期、加強食品安全的生物保藏法逐漸被重視。絕大多數的乳酸菌細菌素如nisin只對親緣關系較近的革蘭氏陽性菌有較好的抑菌效果，大大限制了其在食品工業中的應用。因此篩選得到對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌效果的細菌素就顯得非常重要。酸菜發酵是一個由乳酸菌主導的過程，其中以腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為最主要的優勢菌種，因此發酵酸菜是篩選乳酸菌的天然材料。Zhao等[14]從東北蘿卜泡菜中篩選出1株具有抑制多種G+菌及G-菌的廣譜抑菌活性的植物乳桿菌?？鼔翡舻萚15]從云南自然發酵酸菜液中分離出12株乳酸菌，4株性狀優良的乳酸菌經鑒定后為植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和短乳桿菌。

本試驗利用瓊脂擴散法從傳統酸菜中分離出一株具有廣譜抑菌活性的乳酸菌SY5，經鑒定為戊糖乳桿菌。戊糖乳桿菌最初被鑒定為植物乳桿菌，隨著分子生物學的發展，利用rec A基因和發酵戊糖的性質將其單獨劃分為戊糖乳桿菌。由于具有特殊的抗菌和調節免疫功能等益生性質，戊糖乳桿菌在乳制品、發酵谷物蔬菜和發酵肉制品等中廣泛存在，同時在功能性食品的開發中也發揮重要作用[16-17]。研究發現，SY5能夠產生具有熱穩定性和酸穩定性的細菌素，對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌等條件致病菌，以及熱殺索絲菌和鮑氏不動桿菌等常見的肉制品腐敗菌都有很好的抑制效果，屬于廣譜的細菌素。與目前已知的大多細菌素一樣，具有蛋白酶敏感性。這種性質保證了細菌素在經食物進入人體后，容易被體內的蛋白酶降解，不會對機體帶來危害[18]。由于乳酸菌在發酵過程中不僅產生細菌素，還會產生具有抑菌活性的乳酸等有機酸。因此，復篩時在發酵上清液加入過氧化氫酶，并把pH值調節到5.5，以排除H2O2和有機酸的干擾。熱穩定性試驗表明，該細菌素121℃處理30 min后，依然保留80%以上的抑菌活性，適合應用于食品加工和貯藏過程，這與已報道的 sakacin C2[19]、ent35-MccV[20]等細菌素性質相同。此外，該細菌素具有耐酸不耐堿的性質，適合在酸性食品中應用。

綜上，本文從傳統酸菜中分離出一株具有廣譜抑菌活性的戊糖乳桿菌，在食品防腐等方面具有潛在的應用價值。未來的研究集中在分離純化出戊糖乳桿菌SY5產生的細菌素，并進行結構鑒定和抑菌機制探究，為其應用提供理論基礎。