高效液相色譜-串聯質譜法測定黃瓜與土壤中烯酰嗎啉和氰霜唑及其代謝物的殘留量

趙民娟，郭虹娜，邵 華*，金 芬，金茂俊，佘永新，王珊珊，鄭鷺飛，王 靜

(1.中國農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，農業部農產品質量標準研究中心，北京 100081；2.南京農業大學 食品科技學院 ，江蘇 南京 210095)

烯酰嗎啉(Dimethomorph)，化學名稱為(E,Z)-4-[3-(4-氯苯基)3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰]嗎啉，有E體和Z體兩種異構體，屬于羧酸酰胺類真菌殺菌劑，對卵菌綱真菌具有專一性。該化合物通過破壞靶目標生物細胞壁膜的形成，引起孢子囊壁分解，進而導致病菌死亡。目前已登記在菠菜、觀賞牡丹、花椰菜、黃瓜等13個作物上，主要用于防治晚疫病、疫病、霜霉病、黑脛病、早疫病等[1-5]。氰霜唑(Cyazofamid)，化學名稱為4-氯-2-氰基-5-對甲基苯基-咪唑-1-N，N-二甲基磺酰胺，是日本石原株式會社研制，與BASF公司共同開發的一種磺胺咪唑類殺菌劑，為超級保護性殺菌劑，可通過作用于線粒體電子傳遞絡合物ⅢQi部位來抑制線粒體呼吸作用，同時能阻礙孢子萌發至孢囊形成的各個階段，從而達到抑制病菌生長的目的。氰霜唑已登記在番茄、觀賞菊花、黃瓜、荔枝樹、馬鈴薯、葡萄、西瓜7個作物上，主要用于防治霜疫霉病、疫病、晚疫病、霜霉病等[6-12]。氰霜唑在使用后會迅速分解，4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)是氰霜唑在植物體內的主要降解產物，比氰霜唑的毒性高，兩者在農產品中的殘留可能會給人類健康帶來潛在風險[13-14]。因此，我國規定黃瓜中烯酰嗎啉的最大殘留限量(MRL)值為5 mg/kg，黃瓜中氰霜唑和代謝物CCIM之和的MRL值為0.5 mg/kg[15]；日本肯定列表規定黃瓜中烯酰嗎啉和氰霜唑的MRL值均為0.7 mg/kg[16-17]；歐盟規定黃瓜中烯酰嗎啉的MRL值為0.5 mg/kg[18]，氰霜唑的MRL值為0.2 mg/kg[19]，且烯酰嗎啉的殘留定義為“同分異構體之和”，氰霜唑的殘留定義為“氰霜唑及其代謝物CCIM之和”。

目前，烯酰嗎啉的測定方法主要有氣相色譜法[20]、氣相色譜-串聯質譜法[21]、液相色譜法[22]及液相色譜-串聯質譜法[23]等，其中氣相色譜法多采用氮吹以及旋轉蒸發等方式，耗時較長，靈敏度相對較低。王曉環等[24]建立了高效液相色譜-串聯質譜測定煙草和土壤中烯酰嗎啉殘留量的方法。而氰霜唑的檢測方法主要有高效液相色譜法[25-26]和液相色譜-質譜法[27]等。氰霜唑及其代謝產物CCIM的檢測方法主要為液相色譜-串聯質譜法[28]，張翠芳等[29]建立了氰霜唑及其代謝物CCIM在黃瓜和土壤中的殘留檢測方法。雖然目前烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM均有較多的檢測方法，但在我國，復配農藥因其獨特的特點，已被廣泛應用于植物生長中，所以單一農藥檢測方法已不能滿足要求，建立高效的多種農藥同時檢測的方法顯得尤為重要。雖然王艷敏[30]報道了烯酰嗎啉和氰霜唑復配藥物的高效液相色譜測定方法，但其未對實際樣品進行檢測。目前未見關于烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物CCIM同時檢測的文獻報道。

本文以黃瓜和土壤為研究對象，采用QuEChERS/液相色譜-串聯質譜法，建立了黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物CCIM的同步檢測方法；通過兩年三地田間殘留試驗，研究35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑在黃瓜和土壤中的殘留動態及最終殘留量，以期確定烯酰嗎啉和氰霜唑在黃瓜上的安全間隔期，并為其在農產品中的安全使用和風險評估提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

烯酰嗎啉標準品、氰霜唑標準品、CCIM標準品(純度99%，德國Dr.E公司)；35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑(江西禾益化工股份有限公司)；乙腈、甲酸(色譜純，Fisher公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純，北京化工廠)；乙二胺-N-丙基硅烷鍵合相(PSA)、十八烷基硅烷鍵合相(C18)(天津博納艾杰爾科技有限公司)；Milli-Q超純水(法國Millipore公司)。

Agilent 1200液相色譜儀、API2000串聯四極桿質譜儀(美國Agilent公司)；渦旋混合器(北京昊諾斯科技有限公司)；電子天平(北京賽多利斯公司)；高速冷凍離心機(美國Thermo公司)。

1.2 樣品前處理

黃瓜：準確稱取粉碎后的黃瓜樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋2 min，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋2 min后，以8 000 r/min離心5 min，上清液為提取液，待凈化。取1.0 mL上清液于裝有50 mg PSA凈化劑的10 mL離心管中，渦旋2 min，以5 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，上機檢測。

土壤：準確稱取土壤樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，凈化時加入50 mg PSA和50 mg C18凈化劑，其余步驟同上。

1.3 儀器條件

色譜條件：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；等度洗脫，流動相為0.5%甲酸水-甲醇(25∶75，體積比)，流速：0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子模式；噴霧電壓(IS+)：5 500 V；離子源溫度(TEM)：450 ℃；碰撞室入口電壓(EP)：10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：4 V；霧化氣(GS1)：34.5×103Pa；輔助氣(GS2)：82.7×103Pa；氣簾氣(CUR)：89.6×103Pa。多反應監測(MRM)模式下烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM的質譜參數見表1。

表1 多反應監測模式下烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM的質譜參數

*quantitative ion pair

1.4 標準溶液的配制及標準曲線的繪制

分別稱取烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM的標準品0.01 g(精確至0.000 1 g)，用乙腈溶解并定容至100 mL，制得100 mg/L的標準儲備液，-20 ℃保存。分別吸取3種標準溶液1 mL，用乙腈定容至10 mL容量瓶中，配成10 mg/L的混合標準溶液，于4 ℃下避光儲存。根據需要，用乙腈稀釋成不同質量濃度的標準工作溶液，即用即配。

烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM混合標準溶液用乙腈、空白黃瓜和土壤提取液稀釋，配得0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L系列混合標準溶液，在上述液相色譜-串聯質譜條件下測定，重復3次，選擇不同的離子對，分別以3種農藥的進樣質量濃度(x，mg/L)為橫坐標，對應峰面積(y)為縱坐標，建立標準曲線。

1.5 加標回收實驗

在黃瓜、土壤空白樣品中添加0.05、0.1、0.5 mg/kg 3個水平的混合標準溶液，靜置20 min，提取和凈化操作同“1.2”。每個加標水平重復5次，以上述實驗條件測定回收率。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1色譜柱及流動相的選擇考察了不同色譜柱和流動相體系的色譜分離效果。分別以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水為流動相對X Bridge C18色譜柱和Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱進行比較;X Bridge C18色譜柱對目標物的保留能力弱，在2 min之內出峰，且在3種流動相下的峰形均不理想、分離效果較差;Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱對目標物保留能力較好，以甲醇-0.1%甲酸水作為流動相時的峰形和分離效果較好，這是由于在流動相中加少量甲酸可以提高離子化效率，優化峰形，通過優化甲酸水的含量以及與甲醇的體積比，最終選擇Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，甲醇-0.5%甲酸水(75∶25)為流動相。在該條件下烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM均可獲得較好的分離效果和色譜峰形，三者的提取離子流圖見圖1。

2.1.2凈化劑的選擇黃瓜等植物源性農產品的提取液中含有的糖類、色素、脂肪酸和甾醇等雜質會對回收結果產生一定的影響，需除去這些雜質。比較了50 mg PSA+50 mg C18、50 mg PSA以及不加凈化劑對樣品中目標物凈化回收效果的影響。結果表明，黃瓜樣品提取液中加入50 mg PSA+50 mg C18時，回收率偏高(116%～128%)。加入50 mg PSA時回收率符合要求(79.6%～94.4%)，不加凈化劑時因受基質中雜質的干擾，回收率不符合要求(60.8%～66.6%)。土壤樣品提取液選用50 mg PSA+50 mg C18凈化時，回收率符合檢測要求(86.5%～103%)，而單獨使用PSA和不使用凈化劑時，回收率(47.8%～76.8%)均較低。最終確定50 mg PSA為黃瓜樣品提取液的凈化劑，50 mg PSA+50 mg C18為土壤樣品提取液的凈化劑。

2.2 基質效應、線性關系及定量下限

在HPLC-MS/MS分析中，電噴霧離子源易受樣品基質影響，表現出離子抑制或離子增強效應，從而影響儀器的靈敏度和重復性[31]。為消除樣品基質效應，本研究選用空白樣品提取液稀釋標準溶液，以使標樣和樣品溶液具有相同的離子化條件，并考察了烯酰嗎啉、氰霜唑和CCIM在乙腈、黃瓜和土壤基質中的線性范圍、線性方程以及相關系數。結果表明：在0.01～0.5 mg/L范圍內，烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM在上述基質中的響應值與其濃度之間線性良好，相關系數為0.994 6～0.999 8。以方法的最低添加水平為定量下限(LOQ)[32]，得黃瓜和土壤中3種化合物的LOQs均為0.05 mg/kg，低于國內外殘留限量[15-19]，該方法的靈敏度可滿足國內和國際殘留限量的測定要求。

2.3 方法的準確度與精密度

按“1.5”進行加標回收實驗，結果顯示，在0.05～0.5 mg/kg加標范圍內，黃瓜和土壤樣品中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的平均回收率為78%～105%，相對標準偏差(RSD，n=5)為1.3%～14.8%(表2)。表明該方法具有較好的準確度、重復性及精密度，滿足農藥殘留分析的要求。典型加標樣品的色譜圖見圖2，其中烯酰嗎啉為順反異構體[33]，故出現兩個峰，本研究中烯酰嗎啉的檢測量為兩種異構體之和。

表2 黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的加標回收率及相對標準偏差(n=5)Table 2 Average recoveries and RSDs for dimethomorph，cyazofamid and CCIM in cucumber and soil samples(n=5)

2.4 消解動態與最終殘留分析

為驗證該方法的可靠性和實用性，采用本方法對北京市通州區、濟南市歷城區和哈爾濱市三地2015～2016年兩年的黃瓜和土壤田間實際樣品(21 d最終殘留和黃瓜中殘留量)進行測定，供試藥劑為35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑，消解動態實驗中黃瓜施藥劑量(393.75 g a.i/ha)，土壤施藥劑量(1 000 g a.i/ha)，施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采樣。最終殘留試驗按照低劑量(262.5 g a.i/ha)、高劑量(393.75 g a.i/ha)各施藥2次、3次(施藥間隔7 d)，收獲期采一次(采樣距末次施藥間隔期1、2、3、5 d)。結果表明：在黃瓜和土壤消解動態樣品中烯酰嗎啉殘留量分別為ND～7.21、ND～5.20 mg/kg，氰霜唑及其代謝物CCIM之和的殘留量分別為ND～4.32、ND～2.21 mg/kg，在施藥7、14 d后，烯酰嗎啉和氰霜唑殘留量均小于最低檢測濃度，表明黃瓜和土壤樣品中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的最終殘留量隨采收時間的延長呈遞減趨勢(其中ND表示農藥殘留量低于LOQs)，烯酰嗎啉在黃瓜和土壤中的半衰期為1.2～2.1、3.0～9.6 d；氰霜唑與CCIM之和在黃瓜和土壤中的半衰期為0.9～2.3 d、1.8～6.2 d，氰霜唑與CCIM之和比烯酰嗎啉的降解速率快，另外不同地區的降解速率也不同，可能是受天氣、作物生長狀況差異以及土壤類型等因素的影響。在合理的使用情況下，35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑不會造成黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM殘留污染。在黃瓜和土壤樣品中，烯酰嗎啉的最終殘留量分別為ND～7.60、ND～2.22 mg/kg，氰霜唑及其代謝物CCIM之和的最終殘留量分別為ND～3.58、ND～0.31 mg/kg，距采收間隔期3 d的黃瓜中烯酰嗎啉最高殘留量為4.26 mg/kg，氰霜唑及CCIM之和的最高殘留量為0.17 mg/kg，均低于我國規定的黃瓜中烯酰嗎啉的MRL值(5 mg/kg)和氰霜唑及其代謝物之和的MRL值(0.5 mg/kg)，故建議其采收安全間隔期為3 d。

圖2 空白樣品及加標樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank and spiked samplesA:blank cucumber;B:cucumber spiked with 0.5 mg/kg dimethomorph;C:cucumber spiked with 0.5 mg/kg cyazofamid;D:cucumber spiked with 0.5 mg/kg CCIM

3 結 論

本研究基于QuEChERS前處理技術，建立了一種同步檢測分析黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物CCIM的HPLC-MS/MS檢測方法。該方法簡單、快速、靈敏度及準確度高，能夠滿足同時快速檢測和確證黃瓜和土壤中烯酰嗎啉、氰霜唑及其代謝物的要求，可應用于農藥登記殘留田間試驗樣品中的農藥殘留分析。另外，對黃瓜和土壤實際樣品的測定，以及對35%氰霜唑·烯酰嗎啉懸浮劑在黃瓜和土壤中的殘留動態及最終殘留量的分析，可為烯酰嗎啉和氰霜唑的科學使用、在黃瓜上的安全間隔期，以及黃瓜中烯酰嗎啉、氰霜唑及CCIM的殘留分析和風險評估提供重要的數據支撐。