高效液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑

王 可，曹倩玉，趙靈芝，陳龍星，張夢妍

(石家莊市疾病預防控制中心 理化檢驗所，河北 石家莊 050011)

苯氧羧酸類除草劑是世界第二大選擇性除草劑，亦為世界第一大殺除闊葉雜草的除草劑[1]，廣泛應用于小麥、玉米、水稻等禾本科作物，可有效防除水、旱田中闊葉和莎草科雜草[2]。此類除草劑易溶于水，自然降解速度較慢，極易在土壤、水環境及果實中殘留[3]，其代謝產物(尤其是一些鹵化物)可引起人類肝腎損傷和遲發性神經病變[4]。因此，苯氧羧酸類除草劑在環境和食品中的殘留受到越來越多的關注。世界衛生組織(WHO)規定飲用水中苯氧羧酸類除草劑的最大污染物水平(MCL)為0.05～0.07 mg/L[5]；歐盟規定谷物中苯氧羧酸類除草劑的殘留限量為0.01～7 mg/kg[6]；我國食品安全國家標準《GB 2763-2016》規定不同食品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、二甲四氯和麥草畏的殘留限量分別為0.01～2 mg/kg、0.05～0.1 mg/kg和0.5 mg/kg[7]。

目前，苯氧羧酸類除草劑的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[8]、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[9]、液相色譜法(LC)[10]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[11]和毛細管電泳法(CE)[12]等。其中，LC-MS/MS法因具有靈敏度高、定性定量準確、可實現復雜基質中多種物質痕量測定等優點，在農藥殘留檢測方面應用廣泛。國內外文獻對于此類除草劑的檢測對象多為土壤、水體與禾谷類農作物，且主要集中于1種或幾種除草劑[13-15]，而關于嬰幼兒谷物食品(米粉和餅干)中多種苯氧羧酸類除草劑殘留的檢測未見報道。本文采用優化的QuEChERS方法對樣品進行快速處理，以電噴霧負離子多反應監測模式進行檢測，建立了高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)同時測定嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑殘留的檢測方法。該方法操作簡便、分析時間短，精密度高、準確度好，可推廣應用于大批量嬰幼兒谷物食品中苯氧羧酸類除草劑殘留的定性定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Exion-TRIPLE QUAD 5500型高效液相色譜串聯質譜儀(美國AB SCIEX公司)；T660/H型超聲清洗器(德國Elma公司)；C3Ⅰ型臺式離心機(法國Jouan公司)；MS3型渦旋振蕩器(德國 IKA公司)；Milli-Q型超純水機(美國Millipore公司)。

苯氧乙酸(Phenoxyacetic acid)、麥草畏(Dicamba)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、2-甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)、2，4，5-三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)、2，4-二氯苯氧丙酸(2，4-DP)、2-甲基-4-氯苯氧丙酸(MCPP)、游離炔草酸(Clodinafop free acid) 、2，4-二氯苯氧丁酸(2，4-DB)、2-甲基-4-氯苯氧丁酸(MCPB)、2，4，5-三氯苯氧丙酸(2，4，5-TP)純度均大于98.5%，購于Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(美國Dikma公司)、甲醇(美國Fisher公司)、乙腈(美國Merck公司)均為色譜純；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)(美國Dikma公司)；C18(40～50 μm，美國Welch公司)；氯化鈉、無水硫酸鎂(天津永大化學試劑有限公司)。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取適量苯氧羧酸類除草劑標準品，用乙腈配制成20 mg/L的標準儲備液，儲存于-20 ℃冰箱中。取適量各標準儲備液，用乙腈定容，得到1 mg/L的混合標準溶液。根據實驗需要用乙腈逐級稀釋，配成適當濃度的系列標準工作溶液。

1.3 樣品處理

準確稱取1 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入2 mL水浸潤，再加入4 mL含2%甲酸的乙腈溶液，渦旋30 s，超聲10 min，加入0.5 g NaCl，渦旋混勻后以4 000 r/min離心8 min，移取2 mL有機相溶液至盛有0.1 g PSA和0.3 g無水MgSO4的15 mL離心管中，渦旋30 s，以8 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，過0.2 μm濾膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件ZORBAX Eclipse XDB- C18色譜柱(4.6 mm×50 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：4 μL。流動相：A為0.01%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，50% B；0.5～0.6 min，50%～55% B；0.6～2.9 min，55% B；2.9～3.0 min，55%～95% B；3.0～4.5 min，95% B；4.5～4.6 min，95%～50% B；4.6～8.0 min，50% B。

1.4.2質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；離子源電壓：-4 500 V；源溫度:550 ℃；氣簾氣(N2)壓力：275.8 kPa；霧化氣(N2)壓力：379.2 kPa；輔助加熱氣(N2)壓力：413.7 kPa；11種苯氧羧酸類除草劑的母離子、碎片離子、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

采用針泵連續進樣，首先進行母離子掃描(Q1 MS)，獲取目標物的母離子，然后通過子離子掃描(Product ion)獲取其碎片離子，將母離子和2個響應信號較強的碎片離子組成檢測離子對,以MRM掃描方式優化DP和CE。實驗發現，11種苯氧羧酸類除草劑易失去H+，形成[M-H]-，其中2，4-D、2，4-DB、2，4，5-T、苯氧乙酸、2，4-DP、MCPP、2，4，5-TP和游離炔草酸均能得到兩個豐度較高的碎片離子。而MCPA、MCPB和麥草畏僅有1個碎片([M-RCOOH]-) 的響應值較高，由于這3種物質的苯環上均含有氯原子，其同位素[M+2-H]-峰及碎片([M+2-RCOOH]-)的響應值較好。因此，對于此3種化合物，選取其同位素母離子和產生的較強的二級碎片離子作為另一個監測離子對，具體參數見表1。

表1 11種苯氧羧酸類除草劑的色譜保留時間及質譜參數Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters of 11 phenoxy acid herbicides

*quantitative ion

圖1 11種苯氧羧酸類除草劑混合標準溶液(50 μg/L)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 11 phenoxy acid herbicides mixed standard solution (50 μg/L)the peak number was the same as that in Table 1

2.2 色譜條件的優化

比較了有機相為甲醇和乙腈，水相為純水及添加不同含量甲酸(0.001%、0.01%、0.1%)的分離效果、峰形及響應強度。結果顯示，以乙腈為有機相時，各化合物均有較強的響應，分離度較好。以純水為水相時，11種目標物的響應信號較強，但峰形較差，拖尾嚴重且出現分裂峰，加入甲酸后雖改善了峰形但響應受抑制，且甲酸含量越高，抑制作用越大，尤其對MCPB、2，4-DB和苯氧乙酸最為明顯。因此，綜合考慮各種因素，最終選擇0.01%甲酸水溶液-乙腈為流動相，采用梯度洗脫程序進行分離，8 min內可以完成11種除草劑的分析(圖1)。

2.3 前處理方法的優化

QuEChERS作為一種新型的樣品提取凈化方法，由于具有快速(Quick)、簡單(Easy)、廉價(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)和安全(Safe)的特點，近年來受到國內外廣泛關注與應用[16]。該方法常以乙腈為提取劑，NaCl為鹽析劑，并在提取液中加入吸附劑與脫水劑(無水MgSO4)以去除樣品中的雜質和水分。常見的吸附劑有PSA(去除基質中的脂肪酸、有機酸、碳水化合物等雜質)、C18(去除脂肪性和非極性物質)和GCB(去除樣品中的色素和甾醇)[17-18]。

苯氧羧酸類除草劑的化學結構中均含有羧基官能團，屬于酸性農藥。因此，本實驗在傳統QuEChERS方法的基礎上以酸化乙腈為提取劑，考察了甲酸含量分別為0.1%、1%、2%、3%時的提取效率。結果表明，2，4-D、MCPA、2，4，5-T和苯氧乙酸受酸度影響較大，提取率隨酸度升高而增強，但酸度超過2%時回收率變化不大；其他7種除草劑在甲酸含量為2%和3%時，回收率均在60%以上且差異不大。綜上，最終選擇含2%甲酸的乙腈作為提取劑。同時對吸附劑進行了比較，發現GCB對2，4，5-T 、2，4-D 和2，4，5-TP 有較強的吸附作用，C18對苯氧乙酸和麥草畏有較強的吸附作用，而以PSA凈化時目標物的回收率均大于75%，凈化效果較好。對吸附劑用量進行了優化，最終選用0.1 g PSA和0.3 g無水MgSO4進行凈化。

2.4 基質效應

基質效應(ME)是指樣品中目標分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，使用ESI模式檢測時，基質主要影響目標化合物的離子化，使其響應信號增強或減弱，從而形成基質增強或抑制效應[19]。實驗采用同一濃度待測物在基質溶液與溶劑中響應值的比值評價基質效應，比值為80%～120%時，表明基質效應較小，可忽略；比值低于80%或高于120%時，表明有較強的基質抑制或增強作用，需用基質匹配標準溶液進行校正。將不含目標物的樣品按“1.3”方法進行提取和凈化得到基質溶液，分別比較了質量濃度為10、20、50、100 μg/L時米粉和餅干的基質效應，得到ME為85.2%～104.3%，表明無明顯的基質效應，可直接用溶劑標準曲線進行外標法定量分析。

2.5 方法學驗證

2.5.1線性關系、檢出限與定量下限用乙腈逐級稀釋混合標準儲備液，配制成0.5～200 μg/L的標準工作溶液，按照優化的實驗條件測定，以各化合物的質量濃度(x，μg/ L)為橫坐標，相應定量離子對的峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，分別計算得到各化合物的檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)。如表2所示，11種苯氧羧酸類除草劑在0.5～200 μg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.999；方法的LOD為0.1～2.4 μg/kg，LOQ為0.4～8.1 μg/kg。

表2 11種苯氧羧酸類除草劑的線性關系、檢出限與定量下限Table 2 Linear relationships，LODs and LOQs of 11 phenoxy acid herbicides

2.5.2回收率與精密度對米粉和餅干樣品分別進行低、中、高3個水平的加標回收實驗，每個水平平行測定7次，得到11種苯氧羧酸類除草劑的平均回收率為77.4%～99.9%，相對標準偏差(RSD)為1.5%～8.0%(表3)。表明本方法的準確度高，精密度好，可滿足嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑的檢測要求。

2.6 實際樣品的測定

應用本方法對市售22份嬰幼兒谷物食品(14份米粉和8份餅干)進行11種苯氧羧酸類除草劑的同時檢測，其中2份餅干樣品檢出麥草畏，含量分別為8.08、18.42 μg/kg，低于《GB 2763-2016》中谷物類食品的最大殘留限量要求(500 μg/kg)[7]；2份餅干樣品分別檢出2，4-DP(3.05 μg/kg)和MCPP(3.24 μg/kg)；2份米粉樣品分別檢出 MCPB(2.42 μg/kg)和2，4，5-TP(4.50 μg/kg)。目前，我國國家標準中未有針對嬰幼兒谷物食品中苯氧羧酸類除草劑的限量標準，《GB 2763-2016》中的谷物類食品農藥最大殘留限量也未涉及2，4-DP、MCPP、MCPB和2，4，5-TP。

表3 11種苯氧羧酸類除草劑的加標回收率及相對標準偏差(n=7)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 11 phenoxy acid herbicides(n=7)

3 結 論

本文采用HPLC-MS/MS建立了同時測定嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑的檢測方法。實驗對提取劑、吸附劑、色譜-質譜條件分別進行了優化，并考察了基質效應的影響。結果表明，該方法能有效避免基質干擾，前處理操作簡便、分析時間短、準確度高、靈敏度好，適用于大批量嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑的定性定量分析。