紫外光譜法測定金銀花提取物中有機酸的含量

賈學忠

金銀花是臨床中常用中藥，其具有疏風散熱、清熱解毒之功效，多用于治療風熱感冒、溫病發熱、癰腫疔瘡等癥。其主要含有有機酸、黃酮類、揮發油等化學成分，其中有機酸是金銀花的主要有效成分[1]。在含金銀花的中藥制劑生產中，如銀花泌炎靈片，通常是以金銀花提取物作為處方原料藥，其主要成分為綠原酸等有機酸[2]。綠原酸雖為金銀花質量控制的指標成分，但金銀花的內在質量并不是靠單一成分所決定的，而是多種成分相結合，并同時起作用才可達到預期效果[1-2]。本研究采用紫外線光譜法對銀花泌炎靈片中金銀花所含有機酸進行含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外分光光度計（DR600哈希HACH），2F-I型紫外分析儀（上海顧材電光儀器廠），微量進樣器、薄層色譜硅膠預制板G板（煙臺市化學工業研究所提供），CQX25-06超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司，功率250 W，頻率25 KHz），SARTORIUS GOTINGEN精密天平[德國生產，精度0.000 01]，JN-A型精密扭力天平（上海第二天平儀器廠）。

1.2 試藥

綠原酸（成都天源天然產物有限公生產，5 kg/包，批號：110753-201410）為對照品，購自中國藥品生物制品檢定所；三氯化鐵、鐵氰化鉀、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿均為分析純。

2 方法

2.1 對照品溶液制備

先將金銀花綠原酸、異綠原酸置于P2O5，真空環境中干燥24 h，準確稱取干燥后的金銀花綠原酸、異綠原酸對照品各10 mg，并將對照品置于25 ml棕色瓶中，加入適量50%甲醇，混勻，制成濃度為40 μg/ml的高效液相用對照品溶液，準確量取此儲備液1 ml，置于50 ml量瓶中，加入適量50%甲醇，混勻，制成濃度為8 μg/ml的紫外分光光度法的對照溶液。

2.2 待測樣品制備

取金銀花10 g，研成粉末，用70%乙醇溶液回溜2次，每次3 h。在回溜時加入乙醇，第1次乙醇加入量為生藥量的8倍，第2次為6倍，回溜結束后合并提取液，過濾出乙醇，并將其濃縮至相對濃度為1.2～1.5（60°）。測定金銀花中綠原酸、咖啡酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸含量，用紫外吸收光譜掃描金銀花提取物溶液，掃描范圍為220～400 nm，采用偏最小乘法建立樣品紫外吸收光譜與5種有機酸含量之間的校正模型，并考察模型的預測能力。

3 結果

3.1 樣品中5種有機酸含量分布情況

所有樣品中5種有機酸含量分布情況如表1所示。5個校正模型對預測集樣本的預測值與對照值的相關系數均＞0.9，相對預測誤差分別為1.42%、-2.11%、0.36%、5.21%、3.27%。預測結果準確。

表1 樣品中5種有機酸含量分布范圍（%）

表2 有機酸校正重現性實驗參數

3.2 精密度實驗

按照標準曲線項下操作方法重復測定供試品溶液6次，結果顯示RSD為0.31%，n=6，提示精密度良好。

3.3 重現性實驗

準確稱取6份同一樣品，每份樣品重約0.5 g。按供試品溶液制備法制備溶液，按標準曲線項下操作法進行測定。借助PLS法建立金銀花提取物紫外吸收光譜，及6種有機酸HPLC法對照值的重現性校正模型，結果RSD為1.08%，n=6，提示重現性好，見表2。

3.4 穩定性實驗

按標準曲線項下操作法，分別于供試品溶液制備后0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h進行測定，RSD為0.74%，n=6，測定結果表明，樣品溶液在5 h內基本穩定。

3.5 回收率實驗

采用加樣回收法。準確稱取6份樣品，每份樣品重約0.25 g。分別準確加入綠原酸對照品0.25 mg、0.50 mg、1.00 mg，3水平共6份按供試品溶液制備項法進行制備，按標準曲線項下操作。經測試結果發現，樣品在1.00 mg回收率較高。

4 討論

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初開的花。性寒味甘，歸心、肺、胃經，具有疏風散熱、清熱解毒之功效，且有“中藥中的抗生素”之稱，多用于治療風熱感冒、溫熱發病、癰腫疔瘡、熱毒血痢等癥。國內外研究人員對金銀花的化學成分進行了大量研究，發現金銀花提取物及所含有的化學成分具有多種藥理活性[3-5]，主要體現在：（1）抗炎活性：霍曉芳等人研究表明，金銀花提取物中的綠原酸能顯著抑制細胞中NO的釋放，并降低NF-κB p65的表達[6]。（2）抗菌活性：金銀花有著較強的廣譜抗菌效果，通過應用微量量熱法測定金銀花中不同化合物對大腸桿菌代謝的影響，結果顯示不同化合物對大腸桿菌的生長均起到了一定的抑制作用，其抑制效果為：總異綠原酸＞總綠原酸＞總黃酮＞總環烯醚萜。（3）抗病毒活性：金銀花對呼吸道的常見病毒有著顯著的抑制效果，當綠原酸濃度不同所抑制的呼吸道病毒種類也不相同，其中常見的呼吸道病毒為RSV、柯薩奇B3、腺病毒7型、腺病毒3型和柯薩奇B5型等[7-9]。（4）抗氧化活性：綠原酸能夠有效的清除3中活性氧，且其清除能力與濃度呈劑量關系，當綠原酸濃度為0.1 mg/ml時，其對過氧化氫（H2O2）的最大清除率可達95.43%。（5）抗腫瘤活性：當金銀花中綠原酸、原兒茶酸和木犀草素的濃度達到100 μmol/L時可對HepG2肝癌細胞發揮細胞毒作用[10-11]。

在金銀花中藥制劑生產中，如銀花泌炎靈片，通常是以金銀花提取物作為處方原料藥，其主要成分為綠原酸等有機酸，但金銀花中藥制劑的在內在質量并不是靠單一成分所決定的，而是多種成分相結合，因此快速、準確的測定有機酸含量對詳細了解金銀花提取物和控制中藥制劑內在質量有著重要意義[12]。傳統測定金銀花提取物中有機酸含量的方法有HPLC法、分光光度法等，但這些方法的步驟較為繁瑣，分析時間過長，無法滿足中藥生產快速分析的需求。

綜上，紫外光譜法用于測定金銀花提取物中有機酸含量，靈敏度高，重現性好，可建立金銀花提取物中有機酸的紫外光譜定量分析模型，符合對金銀花提取物進行快速分析的要求。