不同產地藍莓關鍵品質因子分析及其抗氧化特性

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(1.華中農業大學食品科學技術學院,湖北武漢 430000; 2.華中農業大學資源與環境學院,湖北武漢 430000)

藍莓為杜鵑花科越桔屬(Vaccinium)多年生落葉或常綠灌木,是一種營養價值很高的水果,富含糖類、維生素、蛋白質、礦質元素等。酚類物質尤其是花色苷類物質含量很高,具有廣泛的生物活性、如抗炎、抗病毒、抗突變、抗癌、防止DNA 損傷、預防心血管疾病等[1]。其中很多生物活性都來源于它的抗氧化作用和對自由基的清除作用。藍莓在世界上許多國家都有種植,我國藍莓種植起步較晚,目前已有20年種植歷史,主產區在我國東北地區,近年來在華北、江浙、遼東半島、華南地區也有種植[2]。隨著人們生活水平的提高,藍莓果以其風味獨特,營養保健功能強受到人們關注[3]。藍莓花色苷是藍莓中主要的關鍵品質因子之一,也是藍莓中主要的抗氧化物質。有研究表明不同產地及氣候條件對藍莓花色苷的含量和抗氧化能力具有一定的影響[4]。目前,國內外有關藍莓品質的研究多集中于不同藍莓品種之間,而對不同產地同一品種藍莓品質特性以及抗氧化能力差異的報道較為少見。因此,分析不同產地環境的同一品種藍莓品質特性及其花色苷抗氧化能力,可以更加深入的了解不同產地藍莓關鍵品質的差異,對藍莓的引種及栽培生產和加工具有實際意義。有研究表明“燦爛”藍莓品質優良,花色苷含量較高,在我國南方地區栽培廣泛。

本研究擬通過對比采自南京、玉溪、貴陽、湖州四個不同地區的“燦爛”藍莓果實為試驗材料,對其內在品質,花色苷抗氧化活性進行了比較,分析了不同產地藍莓品質指標的差異性,并對比分析了不同產地藍莓花色苷抗氧化能力的強弱,旨在為藍莓種植和深加工的進一步發展做出理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“燦爛”藍莓 浙江省安吉縣天子湖鎮高莊村藍莓谷、貴州省三穗縣長吉鄉新盤村、南京市溧水區白馬石頭鎮、玉溪市澄江縣海口鎮海口村,均選擇果實成熟度均勻一致,且無病、蟲害的果實分別進行采收,分裝在帶有小孔的塑料盒(材質:高溫聚酯薄膜,規格:長11 mm、寬11 mm、高4 mm、壁厚0.38 mm;廠家:義烏市尚美塑料有限公司)中,4 ℃貯藏;酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、蒽酮、濃硫酸、硫酸銅、硼酸、亞甲基藍、溴甲酚綠、硫酸鉀、乙醇、鹽酸、葡萄糖、硝酸、高氯酸、VC、乙酸鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、活性炭、酒石酸氧銻鉀、鉬酸銨、乙酸銨、氯化鉀、氯化鍶、乙酸乙酯、正己烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸鐵、過氧化氫(30%)、水楊酸、AB-8大孔樹脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、甲酸、甲醇(色譜純)等 國藥集團化學試劑有限公司。

HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;紫外-可見分光光度計 美國惠普公司;SQP電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;SHB-IIIS循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;半自動凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓理化指標分析

1.2.1.1 藍莓總酸的測定 總酸測定按GB/T 12456-2008,采用酸堿滴定法測定。藍莓果實用榨汁機打漿(功率:250 W、時間:2 min)后取10.00 g,轉入250 mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度、搖勻,用濾紙過濾,濾液待測。準確吸取濾液10 mL放入100 mL錐形瓶中,加入1%酚酞2～3滴,用0.01 mol/L的氫氧化鈉標準溶液(以0.01 mol/L的鄰苯二甲酸氫鉀標定)進行滴定,計算藍莓總酸度。

1.2.1.2 藍莓可溶性總糖含量的測定 蒽酮比色法,取藍莓果實用榨汁機打漿(功率250 W，時間2 min),取5 g藍莓漿,加入20 mL蒸餾水,沸水浴30 min,冷卻后4000 r/min離心15 min,重復2次,上清液過濾定容至100 mL。取1 mL稀釋后的提取液與1 mL 2%蒽酮-80%硫酸(體積比1∶1)混合后,加入5 mL濃硫酸,沸水浴保溫20 min,自然冷卻至室溫,于630 nm處測定吸光值[5]。根據上述方法測得葡萄糖標準曲線,y=0.8705x+0.0028(R2=0.9950)。

式中:N-稀釋倍數,V0-測定時取樣體積(mL),V1-定容總體積(mL),W-樣品重量(g)。

1.2.1.3 藍莓水分含量的測定 水分測定:參考GB 5009.3-2010,采用直接干燥法進行測定。

1.2.1.4 藍莓蛋白質的測定 參考GB/T 5009.5-2016,采用凱氏定氮法進行測定。

1.2.1.5 藍莓礦質元素的測定 礦物質元素測定:參考GB 5009.91-2017、GB 5009.92-2016、GB 5009.241-2017、GB 5009.90-2016與GB 5009.87-2016。

1.2.1.6 藍莓可溶性固形物含量測定 藍莓果實打漿(功率:250 W、時間:2 min),用手持數顯糖度儀測定,直接讀取得到可溶性固形物含量。

1.2.2 藍莓花色苷提取及抗氧化能力分析

1.2.2.1 藍莓花色苷的提取 花色苷提取方法參照陳云霞等[6]的方法,并做進一步改進。花色苷在酸性條件下比較穩定,藍莓果實用體積濃度為60%、pH為3.0(鹽酸調pH)的乙醇作為提取液,料液比1∶10 (g/mL),在40 ℃條件下提取,殘渣按同樣方法提取2次。濾液合并,在40 ℃條件下旋轉蒸發濃縮。濃縮液存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2.2 藍莓花色苷含量的測定 花色苷含量測定參照Lohachoompol等[7]的方法稍作修改,將1.2.2.1中得到的提取液離心抽濾,取1 mL提取液,分別用pH1.0緩沖液(1.49 g KCl用蒸餾水定容到100 mL,HCl調pH至1.0)和pH4.5緩沖液(1.64 g CH3COONa用蒸餾水定容到100 mL,用HCl調pH至4.5)定容至25 mL,分別在510、700 nm下測定吸光值,通過示差法測定。

計算公式:花色苷(mg/mL)={[(A1-A2)-(A3-A4)]×449.2×稀釋倍數×1000×V}/(29600×m)

式中:A1-pH1.0稀釋液在510 nm測得吸光度,A2-pH4.5稀釋液在500 nm測得吸光度,A3-pH1.0稀釋液在700 nm測得吸光度,A4-pH4.5稀釋液在700 nm測得吸光度,V-提取液總體積(mL),m-樣品質量(g)。

1.2.2.3 藍莓花色苷分離純化 取1.2.2.1藍莓花色苷提取液5 mL,加入20 mL正己烷液液萃取去除脂類物質,下層萃取物繼續用乙酸乙酯萃取,萃取物∶乙酸乙酯=1∶4(體積比)去除脂溶性黃酮類物質[8]。之后用AB-8大孔樹脂純化,用pH3.0(鹽酸調pH)、60%乙醇洗脫,洗去糖類物質,提取液洗脫花色苷物質,懸蒸濃縮,真空冷凍干燥[9],即得藍莓花色苷凍干粉。

1.2.2.4 藍莓花色苷總還原能力的測定 VC濃度梯度:取VC儲備液(5 mg/mL)進行梯度稀釋,稀釋后梯度濃度分別為:0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL。

樣品的梯度稀釋:取湖州、南京、玉溪、貴陽四個產地藍莓花色苷凍干粉,用pH=3.0(鹽酸調pH)的酸化水溶解,配制成0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL。

以鐵氰化鉀還原法[10]定花色苷的總還原能力,向試管中加入稀釋至不同濃度的樣品各2 mL,之后加入5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.6)和5 mL的2%鐵氰化鉀溶液,隨后放置在40 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min,流水冷卻至室溫。再向其中加入5 mL 10%三氯乙酸,室溫放置15 min,取5 mL的反應液,向其中加入5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液,混合均勻,反應10 min后使用分光光度計在700 nm的波長下測定吸光度,以蒸餾水代替鐵氰化鉀溶液作為空白對照,以VC作為陽性對照,同樣的方法測定。

1.2.2.5 藍莓花色苷清除羥基自由基能力的測定 VC濃度梯度:取VC儲備液(1 mg/mL)進行梯度稀釋,稀釋后梯度濃度分別為:0.01、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。

樣品的梯度稀釋:取湖州、南京、玉溪、貴陽四個產地藍莓花色苷凍干粉,用pH=3.0(鹽酸調pH)的酸化水溶解,配制成0.01、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。

以水楊酸法測定,向試管中加入1 mL 稀釋至不同濃度的樣品液,隨后加入1 mL FeSO4溶液(9 mmol/L),1 mL水楊酸溶液(9 mmol/L),最后加入1 mL H2O2(2.6 mmol/L)溶液啟動反應,放入35 ℃水浴保溫30 min,510 nm下測定吸光值。以VC作為陽性對照,同樣方法進行測定。記錄吸光度值,平行測定三次,按照公式計算樣品花色苷和VC的羥基自由基清除率[11]。

式中:A-反應體系中以蒸餾水代替樣品測得吸光度,Ai-反應體系中樣品某濃度下測得吸光度,Ai0-反應體系中以蒸餾水代替水楊酸測得吸光度

1.2.2.6 藍莓花色苷清除DPPH自由基能力的測定 VC濃度梯度:取VC儲備液(1 mg/mL,乙醇配制)進行梯度稀釋,pH=3.0(鹽酸調pH)的酸化稀釋,稀釋后梯度濃度分別為:0.025、0.05、0.075、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL。

樣品的梯度稀釋:取湖州、南京、玉溪、貴陽四個產地藍莓花色苷凍干粉,用pH=3.0(鹽酸調pH)的酸化水溶解,配制成0.025、0.05、0.075、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL。

向10 mL離心管中加入3 mL稀釋至不同濃度的樣液,向其中加入3 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L,乙醇配制,4 ℃冰箱避光保存),25 ℃恒溫水浴鍋溫浴 30 min,在 517 nm波長下測定反應液吸光度,平行測定三次,以VC溶液作為陽性對照,DPPH自由基清除率的公式如下[12]。

式中:A-反應體系中以乙醇代替樣品測得的吸光度,Ai-反應體系中樣品某濃度下測得的吸光度,Ai0-反應體系中以乙醇代替DPPH溶液測得的吸光度。

1.3 數據處理

每個實驗平行測定三次,數據處理采用SPSS 17.0(IBM公司)進行數據分析,利用Duncan新復極差法進行顯著性分析,文中圖采用Oringe 8.0(美國OriginLab公司)進行繪制。

2 結果與分析

2.1 藍莓關鍵品質因子分析

藍莓果實營養豐富,關鍵品質因子主要體現在總糖、總酸、水分、蛋白質、可溶性固形物等品質指標上[13]。由表1看出,不同產地藍莓的總酸、總糖含量有顯著差異(p<0.05);湖州產地藍莓總酸含量最高為0.82%,貴陽產地藍莓總酸含量最低為0.39%。總糖含量貴陽藍莓含量最高為11.91%,湖州藍莓含量最低為6.62%。貴陽藍莓糖酸比最高為30.54;可溶性固形物含量為:南京>貴陽>玉溪>湖州,其中,南京藍莓含量最高為15.03%。可溶性固形物、總酸及糖酸比無論是對鮮食還是加工果汁果酒都是重要的考量指標,鮮食藍莓一般選用可溶性固形物含量較高,總酸含量較低,糖酸比適中的品種[14]。通過比較分析可知,貴陽產地藍莓鮮食口感較佳。玉溪藍莓和湖州藍莓在水分含量和蛋白質含量方面無顯著差異(p>0.05)。

表1 不同產地藍莓理化指標(n=3)Table 1 Physical and chemical indicators of blueberries from different producing areas(n=3)

根據鄭紅巖[15]的研究,“燦爛”藍莓水分含量為83.47%,蛋白質含量為545.66 mg/100 g,可溶性糖含量為3.67%,有機酸(以檸檬酸計)含量為1.75%,糖酸比為5.01。李金星等[16]報道,“燦爛”藍莓可溶性固形物含量為12.88%,可溶性糖含量為7.04%,可滴定酸含量為0.73%。楊維[17]等發現“燦爛”藍莓可溶性糖含量為9.58%,有機酸含量為0.52%,可溶性固形物含量為10.83%。本研究四產地“燦爛”藍莓各關鍵品質因子含量與文獻相比含量相當,且不同產地藍莓關鍵品質因子含量均有差異。

2.2 藍莓礦質元素分析

不同產地藍莓果實礦質元素分析結果見表2。從表2可以看出不同產地藍莓果實礦質元素含量不同,在所測的礦質元素中,K含量最高,含量在605.85～757.29 mg/kg。其次為Ca、P含量,Mg、Fe含量較低。K含量南京藍莓最高,湖州藍莓最低。Ca含量由高至低依次為貴陽藍莓、湖州藍莓、玉溪藍莓、南京藍莓。P含量四產地差異顯著(p<0.05),南京藍莓P含量最高為(86.28±1.40) mg/kg,顯著高于其他三個地區,湖州和貴陽藍莓次之,玉溪藍莓P含量最低為(36.29±0.58) mg/kg。Fe含量南京與貴陽藍莓無顯著差異,湖州藍莓含量最高,玉溪藍莓含量最低僅為(2.43±0.37) mg/kg。四產地藍莓Mg含量大小為:玉溪>貴陽>南京>湖州。姜晶[18]測得“燦爛”藍莓K含量為830.00 mg/kg,Ca含量為92.65 mg/kg,Fe含量為60.15 mg/kg。史海芝[19]研究發現,“燦爛”藍莓果實中K含量最高為917.00 mg/kg,P含量為98.80 mg/kg,Ca含量為77.90 mg/kg,Mg含量為51.20 mg/kg。

表2 不同產地藍莓的礦質元素分析(mg/kg,n=3)Table 2 Mineral elements in blueberries from different producing areas(mg/kg,n=3)

通過比較分析表明,藍莓果實的礦質元素含量差異明顯。整體來看Ca、K和Mg元素含量豐富。不同品種藍莓果實中礦質元素含量不同,不同產地同種藍莓果實中礦質元素含量也有差異,有研究表明這是由于水果中的礦質元素含量與果樹品種、土壤質地、土肥水條件和栽培管理技術等因素密切相關[20]。

2.3 藍莓花色苷含量分析

從圖1可知,四產地“燦爛”藍莓花色苷含量存在顯著差異(p<0.05)。其中,貴陽藍莓花色苷含量最高,為(1.6418±0.0123) mg/g,南京藍莓花色苷含量最低,為(0.8339±0.0143) mg/g。玉溪藍莓花色苷含量為(1.1332±0.0231) mg/g,湖州藍莓花色苷含量為(1.3430±0.0240) mg/g。四產地“燦爛”藍莓花色苷含量在0.8339～1.6418 mg/g。吳文龍等[21]研究發現采自南京地區的“燦爛”藍莓花色苷含量為(0.8080±0.0380) mg/g,本文測得南京地區“燦爛”藍莓花色苷含量相與此結果一致。鄭紅巖等[15]測得“燦爛”花青苷含量為(1.5949±0.6750) mg/g,此結果在本實驗四產地“燦爛”藍莓花色苷含量范圍內。可以看出產地不同“燦爛”藍莓花色苷含量不同,產生這一現象的原因可能是由于產地環境因素不同。

圖1 四產地藍莓花色苷含量(mg/g)Fig.1 Anthocyanin content in blueberries from 4 different producing areas(mg/g)

2.4 藍莓花色苷的總還原能力

一般情況下,樣品的還原力與其抗氧化活性有明顯相關性[22]。從圖2可以看到在研究范圍內(濃度0.05～1.0 mg/mL),隨著VC以及藍莓花色苷濃度的增加,吸光值逐漸增大,表明總還原能力漸增強,抗氧化活性逐漸增強,表現出良好的劑量效應關系。其總還原能力可以用半最大效應濃度EC50表示,EC50越小,表明其總還原能力越強[23]。可以看出玉溪、南京藍莓花色苷總還原能力差異較大,貴陽、湖州藍莓花色苷總還原能力差異較小。VC的EC50為0.067 mg/mL,四個產地花色苷的EC50分別為:貴陽0.213 mg/mL,湖州0.234 mg/mL,玉溪0.289 mg/mL,南京0.707 mg/mL。即VCEC50<貴陽花色苷EC50<湖州花色苷EC50<玉溪花色苷EC50<南京花色苷EC50。表明總還原能力VC>貴陽花色苷>湖州花色苷>玉溪花色苷>南京花色苷。李穎暢等[24]研究發現藍莓花色苷還原能力低于同等濃度抗壞血酸還原能力,這一結果與本實驗結果一致。此外李穎暢研究發現抗壞血酸還原能力約為藍莓花色苷還原能力的2.15倍。本實驗VC還原能力約為四產地藍莓花色苷還原能力的3.18～10.55倍,這一結果與李穎暢等研究結論不一致,這可能是由于藍莓花色苷含量及種類不同的原因。

圖2 不同產地藍莓花色苷的總還原能力的比較Fig.2 Comparison of total reducibility of blueberry anthocyanins from different producing areas

2.5 藍莓花色苷的清除羥基自由基的能力

由圖3可知,隨著VC以及藍莓花色苷濃度的增加,羥基自由基清除率也隨之增加。當濃度達到0.4 mg/mL時,湖州藍莓花色苷羥基自由基清除率為79.35%、玉溪和南京清除率相當,分別為68.65%和63.41%,貴陽藍莓花色苷羥基自由基清除率為95.63%,此時VC的清除率已達100%。研究范圍內(濃度0.05～0.5 mg/mL),陽性對照VC清除羥基自由基能力高于四產地藍莓花色苷清除羥基自由基能力。通常用IC50值表示清除羥基自由基能力,IC50值越小,清除羥基自由基能力越強[25]。VC、湖州花色苷、貴陽花色苷、玉溪花色苷、南京花色苷IC50分別為0.1352、0.2693、0.1933、0.2918、0.3545 mg/mL。因此清除羥基自由基能力從高到低依次是VC>貴陽>湖州>玉溪>南京。

2.6 藍莓花色苷的清除DPPH自由基能力

由圖4可知,隨著VC以及藍莓花色苷濃度的增加,DPPH自由基的清除率逐漸增加。湖州、貴陽藍莓花色苷濃度在0.025～0.1 mg/mL之間,清除率幾乎呈線性增加,在此濃度范圍內,VCDPPH清除率由23.8%迅速增加至66.31%,貴陽藍莓花色苷DPPH清除率由16.32%升至43.26%。當花色苷濃度為0.7 mg/mL時,貴陽藍莓花色苷、VCDPPH自由基清除率已達100%。四個產地花色苷的IC50分別為:貴陽0.095 mg/mL,湖州0.114 mg/mL,南京0.289 mg/mL,南京0.203 mg/mL。研究范圍內(濃度0.025～0.7 mg/mL),四個產地藍莓花色苷清除DPPH能力均小于陽性對照VC清除能力。四產地藍莓花色苷清除DPPH能力大小為:貴陽>湖州>玉溪>南京。四個地區藍莓花色苷清除DPPH能力有差異。這可能是由于四個地區花色苷含量及種類不同。

圖4 不同產地藍莓花色苷的清除DPPH自由基能力的比較Fig.4 Comparison of scavenging DPPH free radical ability of blueberry anthocyanins from producing areas

3 結論

本文對比了采自南京,玉溪,貴陽,湖州四個不同地區的“燦爛”藍莓果實品質因子,比較花色苷含量及其抗氧化活性。結果表明,四地區“燦爛”藍莓果實糖含量均較高,總酸含量在0.39%～0.82%,貴陽藍莓含酸量最低為0.39%±0.01%。可溶性總糖含量貴陽含量最高為11.91%±0.20%,湖州含量最低為6.62%±0.04%。可溶性固形物含量貴陽藍莓最高為12.38%,湖州藍莓最底為11.97%。蛋白質含量由高至低依次為:玉溪藍莓>湖州藍莓>南京藍莓>貴陽藍莓;水分含量均較高,達 80.37%以上。果實中除含以上的成分外,還含有豐富的礦質營養元素,具有較高的營養保健價值,其中果實中 K、P含量最高的為南京藍莓,Ca含量最高的為貴陽藍莓,果實中Fe含量的最高為湖州藍莓。其果實中的礦質元素含量綜合排序為K>Ca>P>Mg>Fe均是人體不可缺少的礦物質元素。

四產地“燦爛”藍莓花色苷含量顯著差異(p<0.05),貴陽藍莓花色苷含量最高為(1.6418±0.0123) mg/g,南京藍莓花色苷含量最低為(0.8339±0.0143) mg/g。藍莓花色苷總還原能力,清除DPPH自由基、羥基自由基能力,結果趨勢相同,抗氧化能力強弱均為:貴陽花色苷>湖州花色苷>玉溪花色苷>南京花色苷,且均小于陽性對照VC抗氧化能力。不同產地藍莓花色苷含量不同,抗氧化能力也有差異,總體趨勢為藍莓花色苷含量越高,抗氧化能力越強。

分析不同產地環境的同一品種藍莓品質特性及其花色苷抗氧化能力,可以更加深入的了解不同產地藍莓關鍵品質的差異,為藍莓品種選育、種植和良種采后加工及銷售提供理論參考。