超聲預處理時間對金槍魚皮酶解過程ACE抑制肽釋放的影響

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(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715; 2.邯鄲學院生命科學與工程學院,河北邯鄲 056005; 3.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013)

許多食源性多肽具有血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性,可競爭性結合ACE活性部位的Zn2+,有降壓作用[1],且ACE抑制肽食用安全性高,無毒副作用,對正常血壓沒有影響[2],具有較廣闊的市場前景。目前已經從乳蛋白、玉米蛋白、明膠等食物蛋白中提取出很多種ACE抑制肽[3-6]。金槍魚是一種重要的世界經濟魚類,營養豐富,通常只選取其魚肉進行加工,而魚皮作為副產品沒有被充分利用,造成很大的資源浪費。金槍魚皮富含膠原蛋白,可用作ACE抑制肽的良好來源。因為膠原蛋白的三螺旋區域富含羥脯氨酸(Hyp)或脯氨酸(Pro),因此來自于膠原三螺旋區的肽段C末端多含有Pro,當脯氨酸在C末端的任一位置時,均有很強的降壓活性[7];此外,Hyp可催化ACE抑制肽與ACE結合。但膠原蛋白的三螺旋結構非常穩定,除了金屬蛋白酶,普通蛋白酶很難進入其結構內部,很難接觸活性位點,釋放高ACE抑制活性肽段較難,因而需在酶解前進行預處理,使其三螺旋結構松散,酶切位點暴露。傳統預處理如熱處理、堿液處理等方式操作耗時長,效率低,如以魷魚皮[8]、鱈魚皮[9]等制備膠原ACE抑制肽,酶解前熱處理時間分別長達24、30 h,從而需要尋找更高效的預處理方式,使魚皮ACE抑制肽的釋放效率提高。

本研究利用前期優化的條件制備金槍魚皮ACE抑制肽,對金槍魚皮超聲預處理后再進行酶解,研究不同超聲預處理時間下金槍魚皮ACE抑制肽的釋放過程,并通過紅外光譜、熱穩定性分析超聲處理的魚皮膠原蛋白的結構,旨在明確超聲預處理對金槍魚皮酶解過程ACE抑制肽釋放影響的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚皮 山東中魯遠洋(煙臺)食品有限公司;蛋白酶K:30 U/mg 美國Sigma公司;血管緊張素轉化酶(ACE)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、鄰苯二甲醛(OPA)、L-谷胱甘肽 美國Sigma公司;ACE底物(ABZ-Gly-Phe(NO2)-Pro) Bachem公司。

Multifuge X3R型冷凍離心機 美國Thermo公司;KQ-100B型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技公司;LC-20A高效液相色譜 島津公司;Spectrum 100紅外光譜 美國PerkinElmer公司;Power PacTM基礎電泳儀 美國Bio-Rad公司;Pyris4000差示量熱掃描儀 美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚皮超聲預處理 根據文獻[13]方法處理金槍魚皮,解凍后稱取2 g,加入0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)后進行超聲預處理,超聲條件:功率30%(總功率650 W),超聲5 s后間歇10 s;超聲預處理料液比(g∶mL)為1∶15;超聲時間分別為0、1、5、20、40 min。U0用來表示未處理組,U1、U5、U20、U40分別表示超聲預處理1、5、20、40 min。

1.2.2 酶解液的制備 根據文獻[13]方法制備酶解液,將處理后的金槍魚皮,加入蛋白酶K(酶底比1 mg/g),在37 ℃恒溫搖床上酶解,當酶解時間分別達到5、30、60 min后,立即90 ℃水浴15 min滅酶,冷卻后在6000 r/min離心15 min,再用0.45 μm的濾膜過濾其上清液,即為酶解液,將一部分冷凍干燥備用。

1.2.3 水解度的測定 參考Zhang等[14]的方法測定水解度。5 mmol/L OPA工作液的制備:由10 mL 50 mmol/L NAC溶液,10 mL 50 mmol/L OPA溶液,75 mL 0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH9.4)和5 mL 20%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液配制而成,現配現用。

將40 μL的酶解液和5 mmol/L的 OPA工作液4.8 mL混勻反應10 min后,在λ340 nm處測定吸光值,空白組為水代替酶解液。水解度的計算公式如下:

式(1)

式(2)

式中:N為膠原蛋白理論肽鍵數;n為水解液中斷裂的肽鍵數;A340為340 nm處的吸光值;M為蛋白質的分子量(300 kDa,以膠原蛋白分子量概算),Da;d為稀釋系數;ε為340 nm處的消光系數(6000 mol·cm);c為蛋白質濃度,g/L,以魚皮中蛋白含量(21.08%)計[13]。

1.2.4 ACE抑制率的測定 參照Zhang等的方法,稍加改動[14-15]。取50 μL酶解液于黑色滴定板(96孔)中,加入6 mU/mL ACE溶液50μL 后,于熒光酶標儀振蕩10 s,并在37 ℃下反應10 min,然后在每個反應孔中加入200 μL 0.45 mmol/L ACE底物反應液(ABZ-Gly-Phe(NO2)-Pro)后進行動力學測定,每隔1 min測量一次,其中激發波長為360 nm,吸收波長為415 nm。

式(3)

式中:α為熒光吸收值與測定時間回歸曲線的斜率。用Tris緩沖液(pH8.3)代替酶解液用作陽性對照組,將ACE溶液代替Tris緩沖液用作空白對照組和陰性對照組[14]。

1.2.5 分子量的測定

1.2.5.1 SDS-PAGE電泳 將酶解液與上樣緩沖液按4∶1 (v/v)的比例混合,沸水浴5 min后迅速冷卻。電泳分離膠為10%,濃縮膠為5%,上樣量為15 μL。

1.2.5.2 酶解液的分子量分布 將5 mg酶解液凍干粉溶于2 mL流動相中,采用高效液相色譜(HPLC)分析多肽分子量的分布情況。色譜柱:TSK gel G2000 SWXL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm);流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;檢測波長:220 nm;采用30%乙腈(含有0.1%的三氟乙酸)進行等度洗脫。根據文獻[13]選用4種分子量標準多肽樣品細胞色素C(Mw=12384 Da)、抑肽酶(Mw=6511.44 Da)、桿菌肽(Mw=1422.69 Da)、谷胱甘肽(Mw=612.63 Da)。

1.2.6 超聲預處理對金槍魚皮膠原蛋白結構的影響

1.2.6.1 熱穩定性分析 稱取5 mg超聲預處理后的金槍魚皮凍干粉,用鋁坩鍋密封后放入DSC儀,以 5 ℃/min速率從-5 ℃升溫至180 ℃,記錄其吸熱曲線。

1.2.6.2 紅外光譜分析 取2 mg超聲處理后的金槍魚皮凍干粉,與溴化鉀研磨混勻,60 ℃烘干之后壓片,掃描紅外光譜圖,掃描范圍為400～4000 cm-1,掃描次數64次,分辨率4 cm-1。

1.3 數據分析

采用SPSS 18.0進行統計學分析,使用Spectrum進行紅外光譜分析,并用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲預處理對水解度的影響

由圖1可知,各組酶解液的DH隨酶解時間增加整體呈現升高趨勢。酶解5 min時,超聲預處理組都和未超聲組差異顯著(p<0.05),說明超聲預處理改變了膠原蛋白構象,在酶解初期使其酶解模式發生改變。但隨著酶解的進行,超聲對其酶解模式影響并沒有持續,酶解30 min時超聲組的DH均未顯著高于未處理組(p>0.05),說明超聲預處理僅暴露了部分結合位點,并未完全破壞膠原蛋白結構。酶解60 min后,超聲處理對膠原酶解的影響再次出現,超聲20、40 min組的DH均顯著高于未處理組(p<0.05),表明超聲預處理可能會對整體酶解過程有促進作用。

圖1 超聲預處理對金槍魚皮膠原蛋白酶解液水解度的影響Fig.1 Effects of ultrosound pretreatment on the degree of hydrolysis of tuna skin collagen注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05);圖2同。

2.2 超聲預處理對金槍魚皮ACE抑制肽釋放的影響

總體而言,超聲預處理組酶解液ACE抑制率均比未處理組高,說明超聲可促進酶解過程ACE抑制肽釋放。超聲產生的空化作用可使膠原蛋白結構展開,造成內部酶切位點暴露,促進其與蛋白酶K的結合[16]。經5 min酶解后,超聲1 min和20 min后酶解液的ACE抑制率顯著升高(p<0.05),與其水解度較高一致,但DH最高的超聲40 min組沒有出現較高的ACE抑制活性,即此酶解液中高活性ACE抑制肽段所占比例較低。隨著水解進一步進行,超聲處理40 min組的ACE抑制率明顯升高,且接近或高于其他處理組,可能與其蛋白結構被破壞以及酶切位點暴露的程度有關。在超聲處理組中,超聲預處理后只要短時酶解(5 min)即可達到較高的ACE抑制率,說明超聲預處理對金槍魚皮膠原蛋白結構有一定破壞作用,使其酶切位點暴露,有助于ACE抑制肽快速釋放。

圖2 超聲預處理對金槍魚皮酶解液ACE抑制率的影響Fig.2 Effects of ultrosound pretreatment on the ACE inhibitory activity of tuna skin collagen hydrolysate

2.3 分子量分布

利用SDS-PAGE電泳圖分析20 kDa以上的大分子蛋白含量,同時利用HPLC分析10 kDa以下的小分子多肽含量變化。由圖3和圖4可知,不同超聲處理組的組分含量隨酶解時間增加呈現往復增減變化趨勢。酶解5 min時,超聲1～20 min后水解液組分明顯增加,并且隨著超聲時間增加,條帶顏色逐漸加深,結合ACE抑制活性變化趨勢,表明超聲1～20 min預處理能有效暴露膠原內部位點。超聲40 min樣品未出現任何條帶,可能是因為長時間超聲造成膠原大量位點暴露,短期酶解使大量多肽溶出,并作為底物被進一步降解為小分子短肽,分子量均低于20 kDa,因此在電泳圖上沒有條帶。圖4顯示酶解5 min超聲40 min水解液中小分子含量大于95%證明了這一假設,在此過程許多有高ACE抑制活性的多肽可能發生進一步降解,使ACE抑制活性偏低。

圖3 不同超聲預處理組酶解液的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of hydrolysate by different pretreatment注:M:標準蛋白。

圖4 不同超聲預處理組酶解液10 kDa以下多肽的分子量分布Fig.4 Molecular weight(under 10 kDa)distribution of hydrolysate by different pretreatments

酶解30 min時,未處理組、超聲1 min和5 min組電泳條帶均減少,小于10 kDa的組分含量則大幅上升,這是因為蛋白酶與溶液中的位點接觸幾率遠高于不溶性膠原主體,從而進一步降解此時溶液中的多肽。而超聲40 min組樣品則呈現相反情況,電泳條帶增加,小于10 kDa的組分含量下降,說明溶液中的作用位點被耗盡后,蛋白酶進而將不溶性底物酶解,使溶液中大分子多肽比例增加。酶解60 min時,每組酶解液分子量繼續呈現往復增減的變化規律。說明超聲預處理后在酶解初期可以加速該規律進行,進而使ACE抑制活性肽段釋放加速,然而當進一步酶解時,該規律可能繼續呈現至膠原結構徹底崩潰,超聲預處理對于酶解的影響也會隨著酶解的進行逐漸減小。

2.4 超聲預處理對金槍魚皮膠原蛋白結構的影響

2.4.1 超聲處理后魚皮膠原熱穩定性分析 通過熱穩定性分析可以判斷超聲處理對原料的破壞程度,并可結合水解液ACE抑制率進一步分析位點暴露情況。由圖5(表1)可以看出,未處理金槍魚皮經DSC掃描圖譜顯示僅有一個大峰,但經超聲處理1、5 min后,靠近主峰處增加了一個小峰,超聲處理20、40 min后增加了兩個小峰,即隨著超聲時間增加,DSC圖譜在比主峰溫度低的地方有規律地增加小峰。小峰可能是膠原蛋白的多肽片段或蛋白質的氧化造成的[17-18],但由于試驗中未超聲組和超聲處理組操作時間相同,應該不是氧化所致,該小峰應為膠原蛋白多肽片段。這可能是金槍魚皮經超聲處理后,破壞了膠原蛋白共價交聯鍵,促進了膠原片段的溶出,小峰表現為小分子片段。將超聲后魚皮樣品棄去上清液,收集沉淀干燥后經DSC驗證,DSC圖譜中僅有一個峰(表2),且趨勢與主峰熱變性溫度趨勢一致說明確實是超聲導致的膠原片段溶出而產生的小峰。

圖5 不同超聲預處理組的膠原蛋白DSC圖譜Fig.5 DSC picture of collagen treated with different ultrosound pretreatments

峰溫度(℃)U0U1U5U20U40主峰63.3761.1461.5762.5667.05第一小峰52.8454.6654.4654.75第二小峰43.4443.81

表2 超聲處理后棄去上清液后魚皮膠原的熱變性溫度Table 2 Tm of fish skin collage after ultrasound pretreatment and centrifugation to discard supernatant

DSC可用于反映膠原蛋白的變性程度[19]。從主峰溫度來看,超聲預處理改變了金槍魚皮膠原蛋白結構,超聲預處理1～20 min均比未處理組低,說明超聲可使膠原構象發生改變,使熱變性溫度降低。但超聲40 min 后,膠原蛋白主峰的熱變性溫度比未處理組高,可能是因為長時間的超聲處理導致膠原中共價鍵被破壞[20-21],大量組分溶出,而未溶出的膠原主體穩定性得到加強,表現為主峰溫度升高。溶出的組分可被短時酶解,使酶解5 min、超聲40 min組酶解液的大分子組分減少。

酶解初期超聲處理5、20 min 組主峰的熱變性溫度比未處理組低,而其ACE抑制率顯著性升高(p<0.05),表明此時超聲主要改變膠原蛋白的三螺旋構象,使更多三螺旋區域的結合位點暴露,快速釋放ACE抑制肽。當超聲預處理時間達到40 min后,蛋白酶迅速水解膠原非主體部分,并進一步降解可溶性大分子組分,造成酶解5 min后無SDS-PAGE電泳條帶存在,酶解液小分子含量高,但部分ACE抑制活性高的肽段可能在該過程中被降解,造成水解液ACE抑制活性偏低。

2.4.2 紅外光譜分析 超聲預處理后金槍魚皮膠原蛋白結構變化如圖6所示。酰胺A帶是N-H伸縮振動的吸收峰,當N-H基團參與氫鍵形成時,其向低波數移動;酰胺B帶是-CH2的不對稱伸縮振動,當-CH2基團參與氫鍵時發生藍移;酰胺I帶是C=O的伸縮振動峰,波數越低蛋白中氫鍵作用越高[22-23]。由表3可知,短時間超聲造成與N-H相關的氫鍵含量增加,長時間超聲則破壞了蛋白分子間的氫鍵,可能是因為長時間超聲造成更多的組分溶出,剩余膠原主體結構中組分減少,造成N-H相關的氫鍵含量相對減少。酰胺B帶向低波數移動,表明維持三螺旋構象的分子間和分子內締結氫鍵減少,表明超聲對膠原蛋白構象有所破壞。超聲預處理后各組的酰胺I帶向高波數移動,說明超聲處理破壞了蛋白結構中C=O參與的氫鍵作用。

圖6 不同超聲預處理金槍魚皮的膠原蛋白紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of tuna skin collagen treated with different ultrosound pretreatments

表3 不同超聲預處理時間的金槍魚皮膠原蛋白紅外光譜特征峰吸收波Table 3 Infrared spectrogram of tuna skin collagen treated with different ultrasound pretreatments

酰胺III帶和1453 cm-1波數的面積比值可反映蛋白三螺旋完整度[24]。由表3可知,金槍魚皮經超聲處理后,三螺旋結構均遭到不同程度的破壞,超聲20 min組的面積比最小為1.157,說明在此條件下三螺旋結構破壞最嚴重,使更多三螺旋區酶結合位點發生暴露,有助ACE抑制肽釋放。超聲40 min后,AIII/A1453比值有所增加,可能是由于部分組分溶出后,剩余的膠原主體結構中類三螺旋結構反而相對更加穩定,這與DSC結果一致。

由表4可知,超聲處理后α螺旋、β折疊比例降低,而無規則卷曲、β轉角含量明顯上升,與胡愛軍等[25]研究結果一致。這是因為超聲破壞蛋白結構,使氫鍵斷裂,α螺旋展開,形成無規則卷曲結構,使更多位點暴露,加速酶解過程的進行,提高三螺旋區活性多肽的釋放效率。但超聲40 min后,其α螺旋、β折疊比例略有增加,β轉角減少,膠原主體的有序性有所增加,與DSC結果一致,即該膠原主體熱變性溫度增加。

表4 不同超聲預處理組金槍魚皮膠原蛋白的二級結構含量Table 4 Secondary structured of collagen that treated with different ultrosound pretreatments

3 結論

超聲預處理對金槍魚皮膠原結構有一定破壞作用,改變了酶解模式,且超聲可促進短時酶解過程膠原三螺旋區域ACE抑制肽快速釋放;同時酶解過程酶解液組分分子量呈現往復增減變化,超聲預處理會加速該規律的進行,以促進膠原整體酶解過程的進行。

DSC結果表明,1～20 min的超聲預處理可導致魚皮膠原熱變性溫度降低,說明短時超聲預處理會在一定程度上破壞膠原蛋白構象,使ACE抑制肽的釋放效率提高;但40 min的超聲預處理導致魚皮熱變性溫度升高,原因在于長時間的超聲處理促使大量組分溶出并快速被降解,使未溶出的膠原主體的熱穩定性略有增加。

FTIR結果表明,超聲預處理破壞了膠原蛋白內部與N-H以及C=O相關的氫鍵平衡,并減少了維持三螺旋構象的分子間以及分子內締結的氫鍵,從而改變蛋白構象。金槍魚皮經超聲預處理后,其α螺旋、β折疊比例降低,無規則卷曲、β轉角比例明顯增加,表明三螺旋結構遭到不同程度的破壞,整體向無序結構轉變,有助于三螺旋區的活性肽釋放;與其他處理組相比,超聲處理40 min后,AIII/A1453比值增大,α螺旋、β折疊含量略有增加,β-轉角含量減少,表明膠原主體有序性有所增加,剩余的膠原主體結構更加穩定,與DSC結果一致。