托盤根不同溶劑萃取物的活性成分及其體外抗氧化活性

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(1.吉林化工學院,化學與制藥工程學院,吉林吉林 132022; 2.吉林化工學院,圖書館,吉林吉林 132022)

托盤(RubuscrataegifoliusBunge.)為薔薇科懸鉤子屬植物,又名牛迭肚、馬林果、山楂葉懸鉤子,為落葉小灌木[1]。廣泛分布于我國東北、華東和中南部地區。托盤既有較高的食用價值,又有藥用價值。其根具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用,民間廣泛用于治療風濕性關節炎、肝炎、痛風等[2]。化學成分研究表明,托盤根中含有黃酮類、皂苷類、鞣質類、芪類等化合物[3-5]。現代藥理學研究表明,托盤根提取物具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、降血壓、抗肥胖、降糖等功效[6-11],托盤根的抗氧化能力研究表明托盤根乙醇提取物和乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取物對動物組織的脂質過氧化具有很強的抑制作用[12-15]。其中酚酸類和黃酮類成分是托盤根體外抗氧化活性成分[5]。目前對托盤根抗氧化活性主要采用其醇提物和不同溶劑萃取物,但對其不同溶劑萃取物中活性成分的含量分析及不同萃取物的體外抗氧化活性的比較還未見報道,因此,本研究用不同溶劑對托盤根水提物進行萃取,測定不同萃取物中總黃酮、總皂苷和總酚酸的含量,并對其體外清除DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子的能力進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

托盤根 采集自吉林市郊區,經長春中醫藥大學李勇教授鑒定為薔薇科懸鉤子植物托盤的干燥根;蘆丁、齊墩果酸、沒食子酸對照品 上海金穗生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2,2′-聯氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過硫酸鉀 上海晶純生化科技股份有限公司;維生素C 天津市致遠化學試劑有限公司;其他試劑 均為分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;SpectraMax Plus384型酶標儀 美國Molecular Devices公司;RE-3000型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;KQ-118型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FA2004N型分析天平 上海精密科學股份有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 托盤根萃取物的制備 托盤根于50 ℃烘箱中干燥,粉碎,過60目篩備用,稱取粗粉100 g,加入1000 mL水,浸泡12 h,加熱回流提取2次,每次2 h,過濾提取液,合并濾液,濃縮得水提液500 mL,加入95%乙醇至含醇量為80%,室溫放置12 h,抽濾,上清液減壓濃縮至無醇味,得托盤根水提物。依次用氯仿、乙酸乙酯、水、飽和正丁醇萃取兩次,各萃取層減壓濃縮干燥后分別得萃取物,即氯仿萃取物(90.9 mg),乙酸乙酯萃取物(323.6 mg),正丁醇萃取物(281.6 mg)及水萃取物(2548 mg)[16]。

1.2.2 總黃酮測定 精密稱取60 ℃干燥至質量恒定的蘆丁對照品10.3 mg,置于50 mL容量瓶中,加入80%乙醇溶解,并用80%乙醇溶液定容至刻度,制得蘆丁對照品溶液(0.206 mg/mL)。精密吸取上述蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,加入4% NaOH溶液4.0 mL,加入80%乙醇溶液定容至刻度,搖勻,放置15 min。以80%乙醇溶液為空白對照,于紫外分光光度計505 nm波長處測定不同濃度蘆丁對照品溶液的吸光度A[17],以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程為:A=13.07c-0.0075,R2=0.9993,其中:A為吸光度,c為黃酮質量濃度(mg/mL)。

取托盤根不同溶劑萃取物,加無水乙醇溶解配制成0.5 mg/mL的樣品溶液,按照上述方法測定樣品溶液的吸光度,平行測定3次,計算平均值,根據回歸方程計算總黃酮的濃度。

1.2.3 總皂苷測定 精密稱取60 ℃干燥至質量恒定的齊墩果酸對照品2.0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入無水甲醇溶解,并用甲醇定容至刻度,制得齊墩果酸對照品溶液(0.2 mg/mL)。精密吸取上述齊墩果酸對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL,分別置于10 mL容量瓶中,與70 ℃水浴上揮發除去溶劑,加入5%香蘭素-冰乙酸2 mL,70%硫酸溶液5 mL,60 ℃水浴加熱20 min,流水冷卻10 min,搖勻,以無水甲醇為空白對照,于紫外分光光度計544 nm波長處測定不同濃度齊墩果酸對照品溶液的吸光度A[18],以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程為:A=0.04435c-0.1968,R2=0.9997,其中:A為吸光度,c為皂苷質量濃度(mg/mL)。

取托盤根不同溶劑萃取物,加無水乙醇溶解配制成0.5 mg/mL的樣品溶液,按照上述標準曲線繪制方法測定樣品溶液的吸光度,平行測定3次,計算平均值,根據回歸方程計算總皂苷的濃度。

1.2.4 總酚酸測定方法 精密稱取60 ℃干燥至質量恒定的沒食子酸對照品2.0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入無水甲醇溶液,超聲使之溶解,并用無水甲醇溶液定容至刻度,制得沒食子酸對照品溶液(0.2 mg/mL)。精密吸取沒食子酸對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加無水甲醇至2 mL,加0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL及0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶0.9)混合溶液1 mL,混勻,在暗處放置5 min,加0.1 mol/L HCl至刻度,混勻,在暗處放置20 min,以無水甲醇為空白對照,于紫外分光光度計720 nm波長處測定不同濃度沒食子酸對照品溶液的吸光度A[17],以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程為A=0.0408c-0.0015,R2=0.9998,其中:A為吸光度,c為皂苷質量濃度(mg/mL)。

取托盤根不同溶劑萃取物,加無水乙醇溶解配制成0.5 mg/mL的樣品溶液,按照上述總酚酸方法測定樣品溶液的吸光度,平行測定3次,計算平均值,根據回歸方程計算總酚酸的濃度。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除能力測定參考文獻方法[19]并稍作修改,DPPH用無水甲醇溶解配制成0.16 mmol/L甲醇溶液。取濃度為0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL的各樣品溶液和濃度為0.02、0.01、0.005、0.0025 mg/mL的VC溶液(陽性對照)100 μL加入96孔板中,并加入100 μL的DPPH測定液,空白用甲醇代替樣品溶液,室溫避光放置30 min。于波長517 nm下測定吸光度。每份樣品平行操作三次。計算公式見式(1):

清除率(%)=[A空白-A樣品]/A空白×100

式(1)

式中:A空白為空白樣品的吸光度,A樣品為測試樣品的吸光度。

提取物的半數抑制率用IC50值表示。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測定 清除ABTS自由基清除能力的測定是參照文獻[20]方法,并稍作修改。將5 mL 7 mmol/L ABTS和88 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀(終濃度)混合,在室溫避光條件下靜止過夜,將生成的ABTS+工作液用水稀釋20～40倍,使其在734 nm波長下的吸光度為0.7±0.02,即得到ABTS+工作液。取濃度為0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL的各樣品溶液和濃度為0.02、0.01、0.005、0.0025 mg/mL的VC溶液(陽性對照)10 μL加入96孔板,并加入190 μL的ABTS+·工作液,空白用甲醇代替樣品溶液。室溫避光放置6 min,于波長734 nm下測定其吸光度。每份樣品平行操作3次。計算公式見式(2):

清除率(%)=[A空白-A樣品]/A空白×100

式(2)

式中:A空白為空白樣品的吸光度,A樣品為測試樣品的吸光度。

提取物半數抑制濃度用IC50值表示。

1.2.7 超氧陰離子自由基清除能力測定 超氧陰離子自由基清除能力的測定參照文獻[16]的方法,并稍作修改。取200 μL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液,20 μL不同濃度(0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL)托盤根萃取物樣品和20 μL蒸餾水(空白對照),25 ℃反應20 min。繼續加入20 μL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,充分振蕩后,在酶標儀中于325 nm處測定0～4 min內每30 s的吸光度,進行線性回歸分析,求其斜率得到鄰苯三酚的自氧化率。不同濃度(0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 mg/mL)的VC溶液作為陽性對照。其清除率按照式(3)計算:

清除率(%)=[A1-A2]/A1×100

式(3)

式中：A1為鄰苯三酚自氧化率;A2為加入樣品的鄰苯三酚自氧化率。

提取物的半數抑制率用IC50值表示。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 托盤根各提取物中總黃酮、總皂苷和總酚酸的含量

如表1所示,各提取物中有機溶劑萃取物的總黃酮含量明顯高于水提物和水萃取物(p<0.05),其中正丁醇萃取物中總黃酮含量為5.06%(以生藥材計),高于乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物,與氯仿萃取物之間存在顯著性差異(p<0.05)。各提取物中正丁醇萃取物的總皂苷含量最高,以生藥材計其含量為7.41%,其次為氯仿提取物,含量為6.29%,乙酸乙酯萃取物中總皂苷含量顯著低于正丁醇和氯仿萃取物(p<0.05),是由于三萜和甾體皂苷元易溶解于氯仿中,與糖結合成苷后極性明顯增加,在正丁醇中的溶解度增大,而皂苷元和皂苷在乙酸乙酯中的溶解度低于氯仿和正丁醇,因而氯仿萃取物和正丁醇萃取物中的總皂苷含量高于乙酸乙酯萃取物。正丁醇萃取物中總酚酸的含量為6.18%,顯著高于氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物(p<0.05),而水提物和水萃取物中總酚酸的含量最低。

表1 托盤根不同提取物中總黃酮、總皂苷和總酚酸的含量Table 1 The total flavonoids,total saponins and total phenolic acid contents of different extract from Rubus crategefolius Bunge.

2.2 托盤根各提取物DPPH自由基清除能力

由圖1可知,托盤根各提取物對DPPH自由基的清除率范圍為5.20%～89.36%,各提取物對DPPH的清除能力均呈現濃度依賴關系。其中清除率最強的為0.2 mg/mL的乙酸乙酯層萃取物(IC50=94.64 μg/mL),最弱的為0.025 mg/mL的水萃取物。相同濃度的樣品中,以乙酸乙酯萃取物對DPPH自由基的清除率最強,水萃取物最低。正丁醇萃取物和氯仿層萃取物比乙酸乙酯層萃取物的清除率略低,不存在顯著差異(p>0.05);水提液和水萃取物的對DPPH自由基的清除率相近,顯著低于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和氯仿萃取物(p<0.05)。此結果表明,不同極性有機溶劑萃取得到的托盤根萃取物中有效成分存在較大差異,如乙酸乙酯和正丁醇萃取物中總黃酮含量高于其他提取物,而黃酮類成分的抗氧化活性較強,與萃取物中總黃酮含量的順序基本相同,說明有機溶劑有利于黃酮類物質的提取。

圖1 托盤根不同提取物DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH scavenging activity of different extracts from Rubus crategefolius Bunge.注:同一濃度下不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖2、圖3同。

由表2可知，各提取物對DPPH自由基的清除能力大小:乙酸乙酯層萃取物>正丁醇層萃取物>氯仿層萃取物>水萃取物。由實驗得陽性對照VC對DPPH清除作用的IC50為6.25 μg/mL,各提取物對DPPH的清除能力均低于陽性對照VC。

表2 DPPH自由基清除率IC50值Table 2 The IC50 values of DPPH scavenging activity

2.5 ABTS自由基清除能力

由圖2可知,托盤根各提取物對ABTS自由基的清除率范圍為4.55%～73.86%,且各提取物對ABTS的清除能力隨濃度的增加而增大。其中清除率最強的為0.2 mg/mL的正丁醇萃取物(IC50=66.43 μg/mL),最弱的為0.025 mg/mL的水提液。相同濃度的供試品溶液中,以正丁醇萃取物對ABTS自由基的清除率最強,水提物最低。乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物比正丁醇萃取物清除率略低,不存在顯著差異(p>0.05);水提物和水萃取物對ABTS自由基的清除率相近,但顯著低于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、氯仿萃取物(p<0.05)。與清除DPPH能力結果相似,總黃酮、總皂苷和總酚酸在有機溶劑萃取中的含量明顯高于水提物和水萃取物,進一步說明,托盤根中的抗氧化活性成分包括總黃酮、總皂苷和總酚酸。

圖2 托盤根不同提取物ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS scavenging activity of different extracts from Rubus crategefolius Bunge.

由表3可知各萃取層對ABTS自由基的清除能力大小:正丁醇層提取物>乙酸乙酯層提取物>氯仿層提取物>水萃取物。且各提取物對ABTS自由基的清除能力均低于陽性對照VC(IC50:17.55 μg/mL)。

表3 ABTS自由基清除率IC50值Table 3 The IC50 values of ABTS scavenging activity

2.6 超氧陰離子自由基清除能力

由圖3可知,托盤根各提取物對超氧陰離子自由基的清除率范圍為2.58%～81.23%,其中清除率最強的為0.2 mg/mL的乙酸乙酯層萃取物(IC50=50 μg/mL),最弱的為0.025 mg/mL的水提液。相同濃度的供試品溶液中,以乙酸乙酯萃取物對超氧陰離子自由基的清除率最強,水提液最低。正丁醇萃取物和氯仿萃取物比乙酸乙酯萃取物清除率低,差異顯著(p<0.05);水提液和水萃取物的供試品溶液對超氧陰離子自由基的清除率相近,但顯著低于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和氯仿萃取物(p<0.05)。

圖3 托盤根不同提取物超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 Superoxide radical scavenging activity of different extracts from Rubus crategefolius Bunge.

由表4可知各提取物對超氧陰離子自由基的清除能力大小:乙酸乙酯層萃取物>正丁醇層萃取物>氯仿層萃取物>水萃取物。且乙酸乙酯提取物對超氧陰離子自由基的清除能力高于陽性對照VC(IC50:90 μg/mL),其他提取物的超氧陰離子清除能力低于VC。

表4 超氧陰離子自由基清除率IC50值Table 4 The IC50 values of superoxide radical scavenging activity

3 結論

本研究對托盤根水提液不同溶劑萃取物中總黃酮、總皂苷和總酚酸含量進行了測定及比較,結果表明托盤根氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物中均含有黃酮、皂苷及酚酸類成分,且明顯高于水提液和水萃取物,其中正丁醇萃取物中各成分含量最高。通過DPPH、ABTS、超氧陰離子清除實驗等體外抗氧化評價體系,評價了托盤根各提取物的體外抗氧化能力,各有機溶劑萃取物均表現出較強的體外抗氧化能力,而其中乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最高。本研究結果表明,托盤根中含有黃酮、皂苷和酚酸等生物活性成分,且具有明顯的抗氧化活性,為進一步開發托盤根成為天然抗氧化劑或健康食品提供了理論基礎。