去除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇乳酸菌的篩選及其作用條件

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(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名嘔吐毒素,化學名稱為3,7,15-三羥基-12,13-環氧單端孢霉-9-烯-8-酮,是一種單端孢霉烯族化合物[1]。嘔吐毒素是鐮刀菌屬的次級代謝產物[2],主要產生菌為禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌,廣泛存在于污染的小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物和飼料中[3]。近年來研究顯示,國內飼料原料霉菌毒素污染超標率高達60%～70%[4-6]。嘔吐毒素污染的谷物,其活性及營養成分含量大幅度降低。當飼料或者糧食中的DON含量超過1 mg/kg時,會對人和動物的健康產生危害,例如厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩、反應遲鈍等急性中毒癥狀,嚴重時損害造血系統,造成死亡[7]。因此,如何有效防控和降解飼料和食品中的嘔吐毒素始終是畜牧業和食品工業亟待解決的科學難題。

目前國內外去除真菌毒素主要有物理、化學和生物方法三大類。物理方法包括熱處理、研磨去殼、輻照法等。物理方法對DON的清除不夠徹底,容易造成二次污染,并且要在很高的溫度或者苛刻的條件下才能去除,成本過高,實際使用較為困難。它們主要對吸附黃曲霉毒素有效,而對DON及其他霉菌毒素無效或效果很有限。能有效地使霉菌毒素解毒或失活的化學物質有:氨氣、亞硝酸鈉、過氧酸、堿、臭氧溶液等[8],對DON的去除徹底迅速。但用化學方法處理谷物、飼料等原材料,不僅破壞食物的營養成分,降低適口性,甚至會引入其他有害物質。生物脫毒是利用微生物在其生長過程的代謝產物或是微生物自身的特性進行脫毒,包括微生物降解和微生物吸附。其過程溫和,不需要使用有害化學試劑,不會造成營養物質大量流失[9]。因此,生物方法作為高效、安全、無污染和條件溫和的處理方法成為研究的熱點。目前國內外對于嘔吐毒素的研究剛剛起步,研究主要集中在嘔吐毒素降解菌的篩選方面。

近年來,很多研究都表明乳酸菌可以去除真菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、單端孢霉烯毒素、伏馬菌素和展青霉素等[10-13]。乳酸菌對霉菌毒素的去除機制可能是細胞壁的吸附或者產生的代謝產物將霉菌毒素轉化成另一種物質[14-15]。但目前研究最多的主要是乳酸菌對黃曲霉毒素的清除,國內關于DON的脫毒研究甚少,相關報道也不多。本實驗從腌魚、泡菜、酸馬奶原材料中以及實驗室保藏的菌株中篩選出能夠清除DON的乳酸菌,為利用該菌株去除飼料中或發酵產品中的DON奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腌魚 來自貴州;泡菜 來自韓國;酸馬奶 來自內蒙古;DON 98%,加拿大TripleBond公司;甲醇 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;植物乳桿菌L163、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、綠色魏斯氏菌、清酒乳桿菌等菌種 由南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室提供;MRS培養基:牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、吐溫80 國藥集團化學試劑有限公司。

TOMY-SX700立式壓力蒸汽滅菌器 日本TOMY公司;SW-CJ-1D型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;Agilent 1100 series高效液相分析系統(配有可變波長紫外檢測器和Instrument色譜工作站) 美國Agilent公司;Eppendorf centrifuge 5804R臺式離心機 德國Eppendorf公司;UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離 在超凈工作臺上取出10 g腌魚、泡菜、酸馬奶,剪碎,放入裝有玻璃珠的250 mL無菌三角瓶中,倒入90 mL 滅菌的生理鹽水,放置于37 ℃,180 r/min的搖床中震蕩30 min后,取出,吸取1 mL培養液于裝有9 mL生理鹽水的試管中,渦旋儀震蕩混勻,連續梯度稀釋,吸取100 μL的10-3～10-6稀釋度的菌懸液,均勻涂布于MRS平板上,37 ℃培養箱中倒置培養24 h。待其長出菌落后,觀察菌落的顏色、大小、隆起度、邊緣形態、干濕狀態及透明程度等,挑取形態等表征有差別的單菌落進行分離純化,劃線接種于MRS培養基,于4 ℃冰箱保藏,用于后續的篩選。

1.2.2 乳酸菌的活化 實驗室保藏菌株,從凍存的甘油管中取出,在MRS平板上劃線培養,37 ℃培養箱中靜置培養48 h后,挑取生長良好的單菌落接種到MRS液體培養基中靜置24 h,培養溫度37 ℃。然后按2%接種量將此活化后的實驗菌株培養液接種到MRS液體培養基中，于溫度為37 ℃的恒溫培養箱中靜置培養24 h,傳代2次。

1.2.3 去除DON乳酸菌的初步篩選 乳酸菌活化2次后,4000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,收集菌體,用生理鹽水洗滌2次,以除去培養基等成分的干擾,最后重懸于生理鹽水中,調整菌體含量至1010CFU/mL以上。加入DON標準品,使得DON的終濃度為50 μg/mL,放置于37 ℃搖床中震蕩培養1 h,取出后再放置于37 ℃培養箱中培養23 h。10000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,取上清,過0.22 μm濾膜,HPLC檢測,計算DON去除率。

1.2.4 去除DON的乳酸菌的復篩 初篩所得去除率30%以上的菌株,菌種保藏管凍存,用于后續實驗。菌株在MRS液體培養基中活化2次后,離心收集菌體,生理鹽水洗滌2次后,重懸于生理鹽水中,調整菌體濃度為1010CFU/mL以上,加入終濃度為50 μg/mL的DON,共培養12、24、36、48 h,并分別取出1 mL,10000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,取上清,過0.22 μm濾膜,HPLC檢測,計算DON去除率。

1.2.5 乳酸菌對DON耐受力的測定 副干酪乳桿菌活化2次后,以2%的接種量分別接種于含DON 0、20、50、100、200、500 μg/mL的MRS液體培養基中,37 ℃培養箱中培養24 h,每隔2 h取樣,利用分光光度計測量600 nm波長下的吸光度值。

1.2.6 菌體濃度對菌株去除DON的影響 乳酸菌活化后,4000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,收集菌體,生理鹽水洗滌2次后,分別調整菌體濃度為5.0×108、1.0×109、5.0×109、1.0×1010CFU/mL以上,pH為7.0,加入DON,使其終濃度為50 μg/mL,分別放置于37 ℃培養24 h,取出1 mL,10000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,取上清,過0.22 μm濾膜,HPLC檢測,計算DON去除率。

1.2.7 溫度對菌株去除DON的影響 按1.2.6方法,調整菌體濃度為1010CFU/mL以上,重懸于生理鹽水中,pH為7.0,加入終濃度為50 μg/mL的DON,分別放置于25、30、33、37、40 ℃培養24 h,其它操作同1.2.6,計算DON去除率。

1.2.8 pH對菌株去除DON的影響 按1.2.6方法,調整菌體濃度為1010CFU/mL以上,分別重懸于pH為4、5、6、7、8的生理鹽水中,加入DON,使其終濃度為50 μg/mL,37 ℃培養24 h,其它操作同1.2.6,計算DON去除率。

1.2.9 DON含量的檢測

1.2.9.1 DON標準曲線的建立 用去離子水配置12.5、25、50、100、125、200 μg/mL的DON標準品溶液,HPLC檢測,建立峰面積與DON濃度之間的一元線性回歸方程。根據不同濃度DON的標準品繪制標準曲線,線性方程為y=33.516x+10.986,相關系數為0.9999,表明DON的濃度在12.5～200 μg/mL范圍內,與對應的峰面積之間具有良好的線性關系。

1.2.9.2 色譜條件 色譜柱為:Aligent 5 HC-C18(2)250 mm×4.6 mm。流動相為甲醇∶水=30∶70,流速為0.6 mL/min,紫外檢測器,檢測波長218 nm,進樣量20 μL,柱溫25 ℃。

1.2.9.3 去除率的計算 以不接菌含有DON的生理鹽水為空白對照組,接菌含有DON的生理鹽水為實驗組,在相同條件下培養相同時間。

式中A:空白組DON的含量,B:實驗組DON的含量。

1.3 數據處理

Excel 2013進行數據分析和繪圖,采用SPSS Statistics 22進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 去除DON的乳酸菌的初步篩選

利用共培養的方式,從150株乳酸菌中初步篩選出32株能夠清除DON的乳酸菌,結果如圖1所示。不同的菌株對DON的去除能力因菌株間差異而各不相同,去除率在15%～40%,選擇去除率在30%以上的乳酸菌Y-30、Y-35、Y-31、Y-33、D-8、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌進行復篩。

圖1 乳酸菌對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的去除率的影響Fig.1 Influence of lactic acid bacteria on the removal rate of deoxynivalenol注:菌株編號“Y”表示菌株來源于腌魚;“P”表示菌株來源于泡菜;“D”表示菌株來源于酸馬奶。已知名稱的菌株來源于本研究室所保藏菌株。(表1同)。

2.2 去除DON的乳酸菌的復篩

對2.1中得到的7株菌株進行復篩,并分別測定12、24、36、48 h下DON的去除率,復篩的結果見表1。隨著時間的延長,DON的去除率會有所變化,且不同菌株變化不一致。大部分的菌株在24 h時去除率達到最大值,36 h后去除率有所降低,可能是部分被吸附的DON又重新釋放到了體系中。鼠李糖乳桿菌對DON的去除效果最好,這和Turner P C[16]等的研究結果一致。但鑒于目前關于該菌株的研究較多,且副干酪乳桿菌對DON的去除率也較高,在24 h時可以清除40.1%的DON,因此選擇副干酪乳桿菌進行下一步研究。Franco等[17]研究發現，經高溫滅活后的副干酪乳桿菌去除DON的能力比活菌提高了一倍多,并且副干酪乳桿菌的發酵上清液能有效抑制禾谷鐮刀菌IAPAR 2218的生長。鑒于副干酪乳桿菌對DON的高效去除能力,以及國內關于副干酪乳桿菌去除DON的研究尚未報道,因此本文選擇副干酪乳桿菌做后續實驗研究。

表1 去除DON的乳酸菌的復篩Table 1 Rescreening of DON removal capability of lactobacillus

根據不含副干酪乳桿菌菌體的對照組的HPLC圖(圖2A)可知,DON的出峰時間時11.4 min左右。對比對照組和實驗組DON的峰面積(圖2B),發現實驗組的峰面積有明顯下降,由液相圖可以直觀地看出副干酪乳桿菌對DON有去除效果。

圖2 副干酪乳桿菌去除DON的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of DON removal ability of Lactobacillus paracasei注：A：不加菌體的空白對照;B：加入菌體的共培養體系。

2.3 副干酪乳桿菌對DON的耐受力

由于嘔吐毒素對細胞有一定的毒害作用,因此乳酸菌對DON的高耐受能力是應用于實際的前提條件。

結果表明(圖3),低濃度(0～20 μg/mL)的嘔吐毒素含量對乳酸菌的生長沒有太大的抑制作用,濃度為20 μg/mL的DON的生長情況與不加DON的空白組生長情況基本吻合。濃度分別為50、100 μg/mL的DON對乳酸菌的生長有輕微的抑制,并且在12 h以前,影響作用不大,在12 h后,生長變得有所緩慢。由此可見乳酸菌對中低濃度的DON有一定的耐受能力。對于高濃度的DON(200 μg/mL),菌體生長緩慢,抑制生長作用較明顯。龔雪[18]研究乳酸菌LB-11對展青霉素的耐受力時,發現在含有不同濃度展青霉素的培養基中,該乳酸菌的生長并沒有受到影響,生長曲線與空白組幾乎重合。這種對DON的高耐受力和去除能力，為利用該菌株去除禾谷原料或發酵產品中的DON奠定基礎,有利于保證人畜的食品和飼料安全。

圖3 副干酪乳桿菌對DON耐受力Fig.3 DON tolerance capbility of lactobacillus paracasei

2.4 菌體濃度對副干酪乳桿菌去除DON效果的影響

菌體濃度的增加對DON的脫毒效果具有明顯的促進作用(圖4)。隨著菌體濃度的升高,副干酪乳桿菌對DON的去除率逐漸增加,當菌體濃度為1.0×1010CFU/mL,去除率高達40%左右。由此可以看出,乳酸菌菌體濃度對DON去除率的影響很大。這可能是由于菌體濃度增多,能夠吸附的DON含量越多。劉暢[19]、駱翼[20]研究益生菌對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的脫毒效果時發現,隨著菌體量的增加,去除效果也越高,與本文研究結果一致。

圖4 不同菌體濃度下副干酪乳桿菌對DON去除率的影響Fig.4 Influence of bacterial concentration on DON-removing-capacity by lactobacillus paracasei注:不同字母代表組間差異顯著(p<0.05)；圖5～圖6同。

2.5 溫度對副干酪乳桿菌去除DON效果的影響

溫度通過影響蛋白質、核酸等生物大分子的結構與功能以及細胞結構如細胞膜的流動性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。過高的環境溫度會導致蛋白質或核酸的變性失活,而過低的溫度會使酶活力受到抑制,細胞的新陳代謝活動減弱。本研究中,在較低溫度25、30 ℃時,去除率在15%左右,而隨著溫度的升高,去除率增加,在37 ℃時,去除率達到最大值35.39%。因此,37 ℃為最適溫度。楊史良[21]研究發現益生菌清除DON的最適溫度為37 ℃,崔玉琦[22]篩選出一株對黃曲霉毒素有降解效果的芽孢桿菌時,發現在37 ℃的溫度下,去除能力最大,可能由于該菌是從腸道中篩選出來的,而動物腸道溫度一般為37 ℃左右。

圖5 不同溫度下副干酪乳桿菌對DON去除率的影響Fig.5 Influence of temperature on DON- removing-capacity by lactobacillus paracasei

2.6 pH對副干酪乳桿菌去除DON效果的影響

環境pH對微生物的生命活動有很大的影響,同時還影響了細胞表面的電荷分布。在研究過程中發現,pH對DON去除率影響較大,在較低pH4、5時,去除率低,在20%左右,隨著pH的升高,去除率增加,在pH7時,去除率達到最大值40.4%(圖6)。最適pH也因菌株、毒素差異而各有不同。Zhao等[23]在研究乳桿菌清除黃曲霉毒素B1去除機理時,發現pH3時,去除率達到最高。龔雪[18]在研究乳酸菌LB-11去除展青霉毒素時,發現pH3～7時,去除能力都較高。

圖6 不同pH下副干酪乳桿菌對DON去除率的影響Fig.6 Influence of pH on DON- removing-capacity by lactobacillus paracasei

3 結論

本研究篩選出了一株能夠清除DON的副干酪乳桿菌,目前國內尚未有相關報道。在DON終濃度為50 μg/mL的體系中,去除率在24 h達到40.1%。同時,對副干酪乳桿菌的脫毒條件進行了研究,包括菌體濃度、pH、反應溫度。研究發現,當菌體濃度達到1010CFU/mL以上時,在反應溫度為37 ℃,pH為7的條件下,去除率達到最大值。利用乳酸菌能夠去除DON的特性,可以將其用于食品或者飼料的發酵,既可以提高食品的安全性,也可以提高食品的營養價值,改善食品風味,同時節約成本,具有潛在的應用前景。