傳統發酵乳制品中植物乳桿菌的種群結構及遺傳進化

,,,,,

(東北農業大學食品學院,乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

乳酸菌因其潛在的益生特性而被廣泛認可。植物乳桿菌是乳酸菌的一種,其兼性厭氧,來源安全,廣泛分布于乳、肉、蔬菜等食材及其發酵制品中[1-2],此外,還存在于人和動物的消化道中[3]。植物乳桿菌通過發酵可轉化生鮮食品中的營養成分[4],提升營養價值,對食品工業和人體健康有著多重有益的功效,具有一定的商業利用價值。

近年來,多種分子分型方法被廣泛應用,包括脈沖場凝膠電泳、限制性片段長度多態性、擴增片段長度多態性、隨機擴增多態性DNA等。但這些方法針對相似營養需求或相近生態位的菌株,其得到的圖譜可能是不準確的[5]。多位點序列分型技術(multilocus sequence typing,MLST)是菌株種內分型的強有力工具[6]。它衍生自多位點酶電泳法,基于部分持家基因,可有效探索菌株的系統發育關系、遺傳進化以及種群結構[7-8]。持家基因是維持細胞基本生命活動所必須的基因,其在所有細胞中均穩定表達。在MLST研究中,所選擇的持家基因需滿足以下條件:具有保守的編碼蛋白的能力;均勻分布于整個基因組;單拷貝,長度不短于1 kb[7]。MLST技術首先應用于流行病學領域,用于致病菌的進化和種群生物學研究,而后拓展至乳酸菌的多樣性和系統進化分析。乳酸菌中利用此法完成分析的菌株包括干酪乳桿菌、德氏乳桿菌、發酵乳桿菌、舊金山乳桿菌、乳明串珠菌等[7,9-12]。對于植物乳桿菌,已有學者對分離自水果、蔬菜、青貯等材料的菌株進行MLST分析[13-14]。

本文利用MLST方法,選取7個持家基因,對分離自內蒙古和西藏自治區傳統發酵乳制品中的植物乳桿菌的種群結構和遺傳進化進行分析,從而在基因水平上為菌株的分型和工業食品發酵劑的篩選提供參考,為后續益生菌發酵產品的開發提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

61株植物乳桿菌分離株 56株分離自內蒙古和西藏自治區傳統發酵乳制品中,1株模式菌株L.plantarumATCC 14917T,4株參考菌株L.plantarumWCFS1、L.plantarumP-8、L.plantarumZJ316和L.plantarumJDM1;MRS肉湯培養基 Sigma公司;磷酸鹽緩沖液 天津市瑞金特化學品有限公司;2×Taq PCR MasterMix 北京天根生物技術有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

YQX-II型厭氧培養箱 上海龍躍儀器設備有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;Bcn1360型生物超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;高速冷凍離心機 上海離心機械研究所;7000 PCR擴增儀 美國Applied Biosystems公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo分光光度計公司;渦旋震蕩器 Mo-Bio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 持家基因的選擇 本研究采用7個持家基因,其中4個基因(pheS、groEL、murC、murE)及其引物是引用Xu等[15]的研究,其余3個基因(recA、recG、ileS)則是選自德氏乳桿菌的MLST研究[9],并以L.plantarumWCFS1的持家基因的基因片段為模板,利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計。所選擇的持家基因及其引物信息見表1。

表1 植物乳桿菌多位點序列分型的持家基因及其引物Table 1 The information of housekeeping genes and primers for MLST of L. plantarum

1.2.2 菌株的培養 將甘油凍存的植物乳桿菌分離株,接種至MRS肉湯培養基,置于厭氧培養箱中37 ℃培養24 h,經傳2代培養至對數期,取2 mL菌液離心后倒掉上清,待用。

1.2.3 DNA的提取、擴增及測序 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取總基因組DNA,具體步驟按照說明書進行操作。使用表1中的引物進行PCR擴增,擴增體系為50 μL,包括16 μL 2×Taq PCR MasterMix,各1 μL引物,4 μL DNA模板,以雙蒸水補足體積。擴增條件為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,適宜退火溫度(表1)30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環;72 ℃末端延伸5 min。擴增后的產物經1%的凝膠電泳進行檢測,將條帶匹配的產物送至北京諾賽生物科技有限公司,進行純化及雙向測序。模式菌株和參考菌株的持家基因序列直接從NCBI數據庫下載獲得。

1.3 數據分析

一個獨特的核酸序列分配一個等位基因號,7個持家基因的不同等位基因號組合構成一個獨特的等位基因譜,也就是序列型(sequence type,ST)。利用MEGA 7.0軟件對序列進行修剪和比對,進而得出等位基因圖譜。利用DnaSP和START軟件計算多態位點數、Tajima’s D值、G+C含量(%)、核酸多態性(π)、非同義突變與同義突變比率(dN/dS)以及IA(index of association)。采用eBURST軟件對ST型進行克隆復合體歸類分析。用MEGA和STRUCTURE對分離株進行系統發育和祖先種群結構探索。采用SplitTree分析菌株的重組情況及遺傳進化關系。

2 結果與分析

2.1 核酸多樣性分析

等位基因遺傳多樣性相關系數如表2所示。7個位點的等位基因數處于3～10之間,pheS基因多樣性較豐富。多肽位點數在3(recG)～12(pheS)之間,π值處在0.00219(groEL)至0.00720(ileS)之間,顯示出較低的位點突變率。Tajima’s D值在-1.33698(groEL)和-0.11553(pheS)之間,均小于0,表明基因序列在進化過程中受定向選擇。G+C含量是細菌遺傳進化研究中的重要指標,本研究中7個基因序列的G+C含量在42.86%(groEL)和50.99%(murE)之間,平均含量為44.88%,高于模式菌株L.plantarumATCC 14917T的G+C含量(44.50%),表明持家基因的保守性較好。同義突變指核苷酸的變異不會引起所編碼的氨基酸的改變,非同義突變指核苷酸的變異會導致氨基酸的改變,本研究中dN/dS均小于1,位于0.021(ileS)～0.927(murC)之間,表明基因變異不會引起氨基酸的變化,其非同義突變受純化選擇,此7個持家基因可用于植物乳桿菌的MLST研究。以上遺傳多樣性相關系數揭示了這些基因處于穩定化選擇[10,12]。

表2 持家基因的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity at L. plantarum loci

2.2 序列型和克隆復合體

不同等位基因的不同組合共分成27個ST型,其中的20個ST型只對應單一菌株。根據生成的等位基因圖譜,利用eBURST軟件規劃克隆復合體來探索菌株的遺傳進化關系。圖1 eBURST圖譜中,每個點代表一個ST型,數字代表該點所對應的ST型編號,點的大小與所對應ST型的菌株數量成正比。7個等位基因中,不少于5個相同等位基因號的ST型劃分為一個克隆復合體(clonal complex,CC)。27個ST型共歸為6個CCs和6個獨特型(singleton)。CC1、CC2、CC4、CC9、CC10和CC23包含90.9%的分離株。在CC1中,ST-1占據中心位置,包含最多菌株數(28株),被認為是CC1的原始序列型。CC1中的多數菌株來自于西藏自治區,而在CC3中則多是分離自內蒙古自治區。ST-10包含兩株分離自發酵乳制品的菌株以及參考菌株L.plantarumP-8,表明來自同一原料的菌株是極為相近的。分離自青貯的參考菌株L.plantarumJDM1同分離自發酵乳制品中的菌株ST-17以單位點差異而共居于CC4,可能是因為它們生活在鄰近的生態位。源自人唾液的L.plantarumWCFS1,健康嬰兒糞便的L.plantarumZJ316以及模式菌株L.plantarumATCC 14917T均是獨特型。綜上分析,可認為相同分離源、分離地的菌株具有相似的核酸多樣性,換言之,不同原料、不同加工方式會影響植物乳桿菌的遺傳進化,加速其對特殊生存環境的適應性。在舊金山乳桿菌和干酪乳桿菌的MLST研究中,提出了加工環境是細菌進化過程中影響其生存適應性的重要因素[7,11]。然而,也有研究學者表示進化和菌株分離源之間并沒有關系[10,13]。而本研究中的菌株是采樣于相對較窄的生態位,因此得出的結論還需進一步驗證。針對這個問題,未來的研究方向會關注于更多樣的分離源、分離地域。

圖1 基于等位基因圖譜的eBURST分析Fig.1 eBURST analysis based on allelic profiles

2.3 種群結構

通過MEGA軟件,采用鄰接法對串聯的序列片段進行聚類分析的結果與利用STRUCTURE評估的種群結構具有較好的一致性(圖2),27個ST型共分成4個遺傳譜系。2B圖中每行代表一個ST型,不同的顏色代表不同的祖先來源。Cluster 1包含13個ST型,其中的菌株多數源自內蒙古發酵乳制品,其中還包含參考菌株L.plantarumP-8、L.plantarumZJ316和L.plantarumATCC 14917T。Cluster 2僅含有1個ST型,包含單一菌株L.plantarumWCFS1。從圖2B中可以看出,超過半數的菌株是單一祖先來源,即每個橫線單一顏色有至少85%的占比。剩余的ST型則是由混合的祖先群體構成,在遺傳重組過程中,每一個顏色所代表的祖先群體既可以是捐贈者也可以是獲得者,因而分離株中呈現了異質的祖先群體結構。Xu等也得出了相同的結論,重組可導致遺傳信息的異質性[15]。

圖2 進化樹及種群結構Fig.2 Evolutionary tree and population structure注:A:基于串聯基因序列獲得的N-J樹;B:由STRUCTURE獲得的祖先來源譜系。

2.4 重組分析

利用IA對植物乳桿菌分離株進行連鎖失衡分析,若IA的值顯著不同于0,則存在克隆結構,期望值為1,反之則存在重組導致的連鎖平衡,期望值為0。本研究中IA和IAS的值分別為1.4364和0.2394(p=0.000),表現出強烈的連鎖失衡,表明這些基因中存在克隆結構。此現象也發生在其他乳酸菌的MLST研究中,如乳酸乳球菌、乳明串珠菌等[12,16]。同樣,在地衣芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌中也已被證實存在[17-18]。

采用重組分解分析來探究分離株的重組現象,在分解分裂圖上,若出現相互交錯的網狀結構或平行四邊形結構則說明重組參與其進化。若出現樹狀圖形,則說明該譜系是克隆結構。在單基因的分解分裂圖上,pheS出現了平行四邊形結構,而其余6個基因則是樹狀結構,說明pheS基因在進化過程中存在重組,剩余6個基因則無明顯的重組現象。針對于pheS基因,在乳明串珠菌的多位點序列分型研究中也發現了重組現象[12]。對串聯的持家基因序列進行重組分解分析,在分解分裂圖上可以明顯的看到網狀結構(圖3),證明植物乳桿菌分離株在遺傳進化過程中受重組影響。并且在植物乳桿菌基因組中存在質粒和一些移動元件,也可能有益于重組的發生[19]。27個ST型分成4組,與進化樹及種群結構譜系的結果相一致。

圖3 重組分解分析Fig.3 Split-decomposition analysis

3 結論

MLST技術是一種有效且分辨率較高的分型方法,被廣泛用于探究菌株的基因多樣性、系統發育關系、遺傳進化及種群結構。本文基于7個持家基因序列，對分離自內蒙古和西藏自治區傳統發酵乳制品中的61株分離菌進行遺傳進化和種群結構探索,在這些分離株的基因上,具有較高的遺傳多樣性,存在克隆結構,且重組影響其遺傳進化。本研究從基因水平為菌株的分型和工業食品發酵劑的篩選提供了新的理論與技術支持,且通過分離得到的植物乳桿菌純化菌株可作為潛在乳酸菌發酵劑,為后續益生菌發酵產品的開發提供菌種資源。