基于Red重組系統的陰溝腸桿菌基因重組技術

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(1.上海大學生命科學學院,上海 200444; 2.中國科學院上海高等研究院，生物煉制實驗室,上海 201210; 3.廣東本科檢測有限公司,廣東汕頭 515071)

Red重組系統是大腸桿菌(Escherichiacoli)中最常用的基因重組系統,該系統從λ噬菌體衍化而來,主要由Exo、Bet、Gam三個基因組成。Exo基因編碼一個5′-3′核酸外切酶,該酶可以作用于雙鏈DNA,產生3′端突出。Bet基因編碼一種單鏈DNA結合蛋白,該蛋白具有介導互補單鏈DNA退火的功能,防止單鏈DNA被核酸酶降解[1]。Gam基因編碼的蛋白能夠與宿主菌的RecBCD核酸外切酶結合,抑制其對外源DNA的降解。由于該系統可以利用具有36堿基同源臂的抗性盒進行基因重組,使得同源臂可以直接合成在引物上,而不需要將目的基因克隆出,使得整個操作過程簡單、高效[2]。目前,已經有學者將Red重組系統改造修飾后用于多種細菌及真菌的基因替換,例如:痢疾桿菌(Bacillusdysenteriae)[3]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[4]、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)[5]、霍亂弧菌(Vibriocholerae)[6]、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)[7]及耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)[8]等。

陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)是一種重要的工業微生物,在自然界中廣泛存在,屬于革蘭氏陰性菌,其生長力旺盛,耐受能力強,培養條件簡單、底物廣泛且底物利用率高。有學者報道利用該菌作為底盤生物發酵葡萄糖可以合成乙偶姻[10]、2,3-丁二醇[11]、雙乙酰[12]和乙醇[13]等化學品;在環境保護方面,E.cloacae也可以用于降解有機磷農藥[14]。陰溝腸桿菌(E.cloacae)[11]、克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)[15]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[16]等多種微生物可以合成2,3-丁二醇。這些微生物中2,3-丁二醇的合成途徑都相同。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的催化下形成乙酰乳酸,乙酰乳酸在脫羧酶的催化下形成乙偶姻,乙偶姻在丁二醇還原酶的催化下形成2,3-丁二醇,這三個酶的編碼基因分別為budB(AlsS)、budA和budC[17]。在課題組前期的研究中,K.pneumoniae的乙酰乳酸脫羧酶(budA)失活后菌株合成乙偶姻和2,3-丁二醇的能力喪失,但是該突變株在低pH高溶氧條件下可以合成高水平的2-酮基葡萄糖酸[18],在中性pH、低溶氧條件下可以合成α-酮異戊酸[19]。現有的報道中,E.cloacae中最常用的基因重組方法是自殺型質粒法[11]。該方法周期較長,敲除效率低,且抗性標記不易消除。為了建立一種適用于E.cloacae的基因重組方法,本文將Red重組系統引入E.cloacae中,并對抗性盒同源臂長度進行了優化。進一步的研究中,研究了利用Flp重組酶系統消除突變株的抗性標記基因。

利用Red重組系統對E.coli進行基因缺失時,常用的質粒為pKD46,其上帶有Red重組酶基因,而在消除抗性標記時常用的質粒為PCP20,其上帶有Flp重組酶基因,兩種質粒所帶抗性基因均為氨芐青霉素[9]。本文所使用的E.cloacae是從自然界篩選得到,天然帶有氨芐青霉素抗性,不能直接將兩種質粒用于E.cloacae的基因重組,因此選用pSC-MSC質粒作為Red和Flp重組酶的表達載體,該質粒的啟動子為溫控型啟動子,在基因敲除時可以較方便的誘導重組酶的表達。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

質粒提取試劑盒、細菌基因組提取試劑盒、PCR清潔試劑盒 Axygen公司;DNA Maker(10kb)、T4 DNA連接酶、限制性內切酶(BamH I、Nco I及Dpn I) Thermofisher公司;kod-plus-Neo DNA聚合酶 TOYOBO公司;Taq DNA聚合酶 康為世紀公司;其余試劑 均為國產分析純,購于國藥;發酵種子用LB培養基進行培養,配方為氯化鈉10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L。發酵用發酵培養基進行發酵,組成成分為:葡萄糖50 g/L,酵母提取物15 g/L,玉米漿粉12 g/L,硫酸銨15 g/L,氯化鉀1.2 g/L,醋酸鈉9 g/L,七水合硫酸鎂0.3 g/L,七水合硫酸亞鐵0.06 g/L,一水合硫酸錳0.03 g/L;實驗所用菌株及來源見表1,實驗所用引物及序列見表2。

表1 菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids

表2 PCR所用引物及其序列Table 2 Oligonucleotides used for PCR

ZHJH-C1115C型超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;S1000 Thermal Cycler PCR儀、MicroPulser電轉儀、1 mm電轉杯、PowerPac Basic電泳儀、Gel Dox XR+凝膠成像儀 BIO-RAD;WFJ 2100型可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;ZWY-2102C型恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;RID-10A/SPD-20A高效液相色譜 SHIMADZU;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器 SANYO;Biostat A Plus發酵罐 Sartorius。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒pSC-MSC-red及pSC-MSC-flp的構建 以質粒pSC-MSC-red的構建為例,利用表2中的引物red-s及red-a以pIJ790質粒為模板擴增red基因,通過TA克隆將red基因連接到pMD18-T載體上,獲得質粒pMD18-T-red。利用限制性內切酶BamH Ⅰ和Nco I分別同時處理pMD18-T-red質粒和pSC-MSC質粒,割膠回收獲得帶有粘性末端的red基因片段及線性載體pSC-MSC。在T4 DNA連接酶的作用下,載體與片段發生連接獲得重組質粒pSC-MSC-red,化轉到DH5α感受態細胞中擴增后提取該質粒,PCR驗證并測序。

構建pSC-MSC-flp質粒時,擴增flp基因用表2中的引物flp-a和flp-s,模板為pDK6-flp,其余步驟與pSC-MSC-red質粒的構建相同。

1.2.2 帶長同源臂抗性盒的構建 以E.cloacae的基因組為模板,利用表2中的引物budAk-s及budAk-a擴增目的基因budA-Ec,所擴基因包含budA原始基因及其上下游500 bp外圍基因。將目的基因budA-Ec連接到pMD18-T載體上獲得質粒pMD18-T-budA-Ec。制作E.coliDH5α/PIJ790的感受態細胞,將菌株劃線于LB固體平板,待長出單克隆后挑取單克隆接種于LB液體試管,過夜培養后轉接至50 mL液體LB培養基中,當細菌生長至OD600=0.5時,冰域放置30 min;4 ℃,5000 r/min離心10 min收集感受態細胞,用預冷的無菌水清洗感受態細胞3次,調整細胞終濃度為OD600=10獲得E.coliDH5α/PIJ790的感受態細胞。設置電轉儀2.0 kV,200 Ω,25 μF將pMD18-T-budA-Ec質粒電擊轉化入E.coliDH5α/PIJ790,獲得含有雙質粒的菌株命名為E.coliDH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec。以PIJ773質粒為模板,利用表2中的引物FRT-s1及FRT-a1擴增出帶有39 bp同源臂的抗性盒。

制作菌株E.coliDH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec的感受態(培養初期時加入10 mmol/L的阿拉伯糖誘導pIJ790質粒上的Red重組酶表達),將含有39 bp同源臂的抗性盒電擊轉化入感受態細胞中,在Red重組酶的作用下,抗性盒與pMD18-T-budA-Ec質粒上的目的基因發生同源重組,獲得重組質粒pMD18-T-budA-Ec-773。

1.2.3 擴增不同長度同源臂的抗性盒 以pMD18-T-budA-Ec-773質粒為模板,用表2中的引物budAk100-a和budAk100-s;budAk200-a和budAk200-s;budAk300-a和budAk300-s;budAk400-a和budAk400-s;budAk500-a和budAk500-s進行PCR,獲得中間為安普霉素抗性基因兩端帶有不同長度同源臂的抗性盒。所得PCR產物用Dpn I限制性內切酶處理消除質粒模板。

1.2.4E.cloacae/pSC-MSC-red的構建 將活化好的E.cloacae接種到50 mL的LB液體培養基中,37 ℃,200 r/min培養,當細胞濃度達到OD600=0.5～0.8時,將培養物置于冰上冰浴30 min。冰浴結束后5000 r/min,4 ℃離心10 min收集細胞,用預冷的無菌水清洗細胞三次,然后將其懸浮于無菌水,調整細胞終濃度為OD600=30,獲得感受態細胞。每100 μL感受態細胞中加入1 μg的pSC-MSC-red質粒,冰浴靜置10 min后進行電擊轉化[20]。電轉儀設置為2.0 kV,200 Ω及25 μF,將電轉杯置于電轉儀中進行電擊轉化[7]。電擊轉化完成后在感受態細胞中加入適量LB培養基,并將其置于37 ℃,200 r/min搖床復蘇1 h。復蘇完成后5000 r/min離心3 min收集菌體,將菌體全部涂布于含有卡那霉素抗性(100 μg/mL)的固體LB培養基上,37 ℃過夜靜置培養。將平板上生長起來的陽性單克隆命名為E.cloacae/pSC-MSC-red。

1.2.5 缺失E.cloacae的budA基因 制作E.cloacae/pSC-MSC-red的電擊轉化感受態細胞,當細菌生長至OD600=0.1時,將培養搖床溫度改為42 ℃,以誘導pSC-MSC-red質粒上的Red重組酶表達,其余過程與1.2.4所述相同。將帶有不同長度同源臂的抗性盒分別電擊轉化入E.cloacae/pSC-MSC-red感受態細胞中,復蘇后涂布于帶有安普霉素抗性(50 μg/mL)的固體LB培養基上37 ℃ 過夜靜置培養。待單克隆生長起來后用表2中的引物budAy-a及Test773做菌落PCR驗證,budAy-a引物以budA-Ec的下游基因為模板設計,Test773引物以安普霉素抗性基因為模板設計。通過測序確認budA基因被成功敲除后將基因缺失菌命名為E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red,該菌株帶有卡那霉素抗性和安普霉素抗性。

1.2.6 消除E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red菌株的抗性標記 消除抗性標記需要Flp重組酶和FRT序列的共同作用[2]。由于pSC-MSC-flp質粒和pSC-MSC-red質粒所用載體均為pSC-MSC,在轉化pSC-MSC-flp質粒前需消除E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red的pSC-MSC-red質粒。方法為將E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red接種于不含抗性的LB液體培養基中,傳代3次后劃線分離得到數個單克隆。將每一個單克隆分別接種到兩種LB培養基中,一種含有100 μg/mL的卡那霉素,另一種不含抗生素。用菌落PCR驗證能在無抗性培養基上長起來且在含卡那霉素抗性培養基上長不起來的單克隆。

將消除質粒的菌株命名為E.cloacaeΔbudA-773,該菌只帶安普霉素抗性,制作該菌的感受態細胞,按照1.2.4的方法將pSC-MSC-flp質粒電擊轉化入該菌中,獲得菌株E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp。將E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp接種到液體LB培養基中42 ℃傳代5次,與消除質粒方法相同篩選出消除了抗性標記的E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp,將其命名為E. cloacae ΔbudA/pSC-MSC-flp。

按照消除pSC-MSC-red質粒的方法消除掉E.cloacaeΔbudA/pSC-MSC-flp的pSC-MSC-flp質粒,得到無抗性標記的budA基因缺失菌,將其命名為E.cloacaeΔbudA,該菌只帶有氨芐霉素抗性。

1.2.7E.cloacaeΔbudA生理特性研究 將E.cloacae及E.cloacaeΔbudA分別接種到50 mL液體LB培養基中,37 ℃,200 r/min培養8 h獲得發酵種子,將該種子接種到總體積為5 L的發酵罐(內含3L培養基)中進行批次發酵。發酵條件為通風量2 L/min,轉速300 r/min,溫度37 ℃,用30%的NaOH溶液控制發酵過程的pH為6.8。發酵過程每3 h取樣檢測葡萄糖、乙偶姻、琥珀酸、乳酸、乙酸、2,3-丁二醇和乙醇等組分的含量變化。發酵液組分測定采用高效液相色譜法,色譜柱為HPX-87H,流動相為0.005 mol/L的稀硫酸溶液,流速為0.8 mL/min,柱溫箱為60 ℃,使用視差檢測器進行檢測[21]。

2 結果與分析

2.1 pSC-MSC-red及pSC-MSC-flp質粒的構建

pSC-MSC-red和pSC-MSC-flp的構建按照材料與方法描述進行。提取的質粒使用引物pSC-s及pSC-a進行PCR驗證。重組質粒pSC-MSC-red的PCR結果見圖1a,重組質粒pSC-MSC-flp的PCR結果見圖1b。圖1a中,泳道2為實驗組在2500～3000 bp位置處有一目的條帶,red基因原始長度為1885 bp,PCR產物中包含的質粒序列為718bp,其總長與目的條帶大小相符,證明pSC-MSC-red質粒構建成功。同理,圖1b中,泳道4為實驗組在1500～2000 bp位置處有一目的條帶,flp基因原始長度為1272 bp,其PCR產物中質粒序列為718 bp,其總長也與圖中目的條帶相符,證明pSC-MSC-flp質粒也構建成功。圖1a及圖1b中陰性對照(泳道1和泳道3)是以pSC-a和pSC-s為引物,以pSC-MSC空質粒為模板擴增得到,說明實驗組的目的條帶為特異性擴增的陽性克隆。兩重組質粒上目的基因序列測定結果與參考序列完全一致。

圖1 重組質粒pSC-MSC-red和pSC-MSC-flp的PCR驗證Fig.1 PCR results of recombinant plasmid pSC-MSC-red and pSC-MSC-flp注:泳道1和泳道3為以空載質粒pSC為模板擴增得到的條帶,泳道2為以pSC-MSC-red質粒為模板擴增得到的條帶,泳道4為以pSC-MSC-flp質粒為模板擴增得到的條帶,Marker為10 kp。

2.2 不同長度同源臂抗性盒的構建

應用Red重組系統進行基因敲除時,不同菌株中所需同源片段長度不同,大腸桿菌為36 bp,而在其他細菌中則稍微長一些。在霍亂弧菌中,50 bp或100 bp的同源臂便足以對目的基因進行敲除,但是其同源臂長度增加到1000 bp時,重組效率顯著提高[6]。在K.Pneumoniae中200 bp同源臂可獲得重組子,500 bp同源臂重組效率顯著提高[7]。為了研究不同長度同源臂對于基因重組效率的影響,本文構建了帶有39、100、200、300、400、500 bp同源臂的抗性盒用于E.cloacae的基因敲除。

按照材料與方法描述過程將帶39 bp同源臂的抗性盒轉入到E.coliDH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec中,用安普霉素抗性平板進行篩選。待菌落生長出來后,挑取部分單克隆使用通用引物M13-47和M13-48進行菌落PCR驗證,結果見圖2。未重組時,以質粒pMD18-T-budA-Ec為模板擴增出來的條帶大小應為1710 bp,圖中泳道7和9對應的單克隆未發生重組。同源重組發生后,部分基因被抗性編碼基因替換,擴增條帶大小應為2410 bp。泳道1、2、3、6、8對應的單克隆成功重組,pMD18-T-budA-Ec-773質粒構建成功。

圖2中,泳道4、5、10含有雙條帶,其原因是pMD18-T載體為高拷貝質粒,轉化入抗性盒后只有一部分pMD18-T-budA-Ec質粒與抗性盒發生了重組,另外一部分pMD18-T-budA-Ec保持未重組狀態。為了解上述問題,在后期的實驗中可以嘗試通過Overlap PCR直接擴增出帶有不同長度源臂的抗性盒。

圖2 重組質粒pMD18-T-budA-Ec-773的PCR驗證Fig.2 PCR results of recombinant plasmid pMD18-T-budA-Ec-773 注:泳道1～10為帶39 bp抗性盒與E.coli DH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec重組后各單克隆菌落PCR驗證結果,Marker為10 kb。

以pMD18-T-budA-Ec-773質粒為模板,擴增出帶有不同長度同源臂的抗性盒,結果見圖3。圖3中泳道1、2、3、4、5分別對應了帶有500、400、300、200、100 bp同源臂的抗性盒;泳道6為以pIJ790質粒為模板使用引物FRT-s1和FRT-a1擴增得到的帶有39 bp同源臂的抗性盒。

圖3 不同長度同源臂的抗性盒的PCR結果Fig.3 PCR results of different length homologous arms注:泳道1、2、3、4、5、6分別為帶有500、400、300、200、100、39 bp同源臂的抗性盒的。

2.3 不同長度同源臂抗性盒的重組效率

為了確定E.cloacae中基因重組所需同源臂的最適長度,分別將帶有39、100、200、300、400、500 bp同源臂的抗性盒轉化入E.cloacae/pSC-MSC-red。待單菌落生長起來后,計算各長度同源臂抗性盒重組的效率。基因重組的效率與所加入的抗性盒DNA的量有關,可以用每1 μg抗性盒DNA轉化入宿主菌后抗性平板上生長起來的單菌落中陽性克隆的個數來表示敲除效率。各長度同源臂抗性盒重組效率見表3。從表中可以看出,同源臂長度為39 bp和100 bp時重組效率為零;同源臂長度增加到200、300及400 bp時,重組效率分別為6.1、14.3和38.8 CFU/μg;同源臂長度增加到500 bp時,重組效率有較大提高,為131.5 CFU/μg。基于此結果,500 bp長度的同源臂抗性盒更適用于E.cloacae的基因重組。

表3 不同長度同源臂抗性盒的重組效率Table 3 Recombination ratios of different length homologous extensions

Red重組酶應用于E.cloacae的基因最高重組效率為131.5 CFU/μg,略低于大腸桿菌(500 CFU/μg)[7],其原因可能是Red重組酶中的Gam蛋白來源于E.coli,其對于E.cloacae的RecBCD核酸外切酶抑制能力較弱。在K.pneumoniae的基因重組中,同樣存在重組效率(266.8 CFU/μg)低于E.coli的情況,通過抑制宿主菌的RecBCD核酸外切酶活性,可以提高Red重組系統在K.pneumoniae中的敲除效率[22]。

2.4 利用Flp重組酶消除E. cloacae ΔbudA-773/pSC-MSC-red菌株的抗性標記

按照1.2.6所述方法消除E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red的pSC-MSC-red質粒。用表2中的引物pSC-a和pSC-s PCR驗證能在無抗性培養基上長起來且在帶卡那霉素抗性培養基上長不起來的單克隆,結果見圖4a。圖中泳道2為消除質粒前的對照,在2500 bp左右處有一目的條帶;消除了pSC-MSC-red質粒后擴增不出條帶(泳道1),說明pSC-MSC-red質粒已經成功消除。

圖4 消除宿主菌外源質粒及抗性標記的PCR驗證Fig.4 PCR results of eliminating the plasmid and resistance marker from E. cloacae ΔbudA-pSC-MSC-flp注:泳道1、3、5為消除菌株質粒或抗性標記基因后的PCR結果,為實驗組;泳道2、4、6為消除菌株質粒或抗性標記基因前的PCR結果,為對照組。

按照1.2.6所述方法傳代培養E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp,使用表2中的引物budAy-a及Test773 PCR驗證能在無抗性培養基上長起來且在帶安普霉素抗性培養基上長不起來的單克隆,結果見圖4b。圖中泳道4為消除抗性標記前的對照,在1500 bp左右處有一目的條帶;消除抗性標記后擴增不出條帶(泳道3),說明E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp菌株的安普霉素抗性標記已成功消除。

按照1.2.6所述方法消除E.cloacaeΔbudA-pSC-MSC-flp的pSC-MSC-flp質粒。用表2中的引物pSC-a和pSC-s PCR驗證能在無抗性培養基上長起來且在帶卡那霉素抗性培養基上長不起來的單克隆,結果見圖4c,其中6號泳道為消除質粒前的對照,在1500～2000 bp處有一目的條帶,消除pSC-MSC-flp質粒后,擴增不出條帶(泳道5),說明pSC-MSC-flp質粒已經成功消除。

2.5 E. cloacae ΔbudA生理特性研究

為了考察敲除E.cloacae的budA基因后其生理特性的變化,將E.cloacae及E.cloacaeΔbudA分別接種到發酵罐中進行批次發酵,其結果見圖5,其中圖5(a)和圖5(b)為E.cloacae的發酵結果;圖5(c)和圖5(d)為E.cloacaeΔbudA發酵結果。E.cloacae發酵過程中合成了一定量的乙偶姻且2,3-丁二醇產量逐漸增加,而E.cloacaeΔbudA整個發酵過程都不再合成乙偶姻和2,3-丁二醇。此外,敲除E.cloacae的budA基因后,菌株的生長變緩,野生型菌株在9 h左右底物全部耗盡,菌體生長進入平穩期,OD600為13.79。而突變株發酵9 h還有16.69 g/L的葡萄糖殘余,OD600只有12.03。細菌代謝糖類合成乙酸或乳酸等酸類物質時,大量有機酸會對菌株的生長產生抑制作用,而醇類物質對菌體的抑制作用要低很多[23]。在E.cloacaeΔbudA中,敲除了乙偶姻的合成基因,2,3-丁二醇的合成被阻斷,細菌合成較多有機酸使得生長變緩。

圖5 E. cloacae及E. cloacae ΔbudA批次發酵結果Fig.5 Batch fermentation of E. cloacae and E. cloacae ΔbudA注:(a)和(b)為E. cloacae發酵結果;(c)和(d)為E. cloacae ΔbudA發酵結果。

發酵15 h后發酵液中各組分具體含量見表4。從表中可以看出,野生型菌株合成了(0.97±0.08) g/L的乙偶姻和(12.25±0.71) g/L的2,3-丁二醇以及其他一些有機酸等代謝產物,而E.cloacaeΔbudA的發酵液中檢測不到乙偶姻和2,3-丁二醇,主要代謝產物為琥珀酸和乳酸。發酵結果進一步說明E.cloacae的budA基因已被成功缺失。

表4 E. cloacae和E. cloacae ΔbudA發酵結果Table 4 Batch fermentation of E. cloacae and E. cloacae ΔbudA

3 結論

本文以budA基因為例,詳細地敘述了Red重組系統在E.cloacae基因重組中的應用。構建了重組質粒pSC-MSC-red質粒和pSC-MSC-flp質粒,在Red重組酶的作用下成功敲除了E.cloacae的budA基因,并通過Flp重組酶成功消除了突變株的抗性標記。運用本文的方法對E.cloacae進行基因缺失的周期一般為3個周。除了budA基因外,運用該系統還成功地缺失了E.cloacae的一些其他基因。總的來說,該系統的建立,有利于快速構建E.cloacae的單基因和多基因重組突變株,將促進E.cloacae的代謝工程改造和其在多方面的應用。