絲膠抗凍肽在大腸桿菌中的重組表達及其抗凍活性初探

, ,吳鴻,*,, ,

(1.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240; 2.福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350108)

絲膠是一種蠶絲產生的水溶性蛋白質[1]。研究表明,來源于絲膠的多肽具有抗氧化[2]、抗腫瘤、抗衰老[3]和抗菌等作用。在最近的研究中,絲膠及其多肽已被證明具有結合冰的能力,這種特性使絲膠具有特殊的抗凍活性[4],在冷凍食品加工與儲藏[5-6]、細胞保藏、抗凍農作物栽培、漁業養殖、器官移植和冷凍手術等領域開發中具有廣闊的商業應用前景。

食品在冷凍、儲存、運輸和凍融過程中產生的冰晶生長和重結晶問題，是制約冷凍產品品質的關鍵[7],因此如何控制冰晶的生長和重結晶是保持或提高冷凍食品品質迫切需要解決的技術難題。天然分離純化所得到的產物數量微少而且成本高昂,嚴重制約了天然抗凍蛋白在食品領域的研究和應用[8]。目前已經有相關研究在抗凍肽的結構和功能研究基礎上,探索通過應用現代生物技術,采用化學合成和基因工程生物表達的方法進行抗凍肽的制備[9-12]。Tsujimoto等[13]發現一種外源基因表達的絲膠肽對細胞和蛋白質有冷凍保護作用。張黨權等[14]以pET-11a為載體構建了胡蘿卜抗凍蛋白非融合表達的重組質粒,并在大腸桿菌菌株BL21(DE3,pLysS)中成功地進行了高效表達。生物學活性研究[15-16]表明,重組表達的抗凍蛋白具有很強的熱滯活性和提高細菌耐寒性的作用。

本文通過基因工程方法,成功構建了一種絲膠抗凍肽在大腸桿菌中的重組表達系統,并對其抗凍活性進行研究,為今后實現新型抗凍肽在冷凍食品加工中的應用提供新的理論參考與技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Pet32a載體 上海少辛生物科技有限公司;DH5α菌株,大腸桿菌BL21(DE3) 生工生物工程(上海)股份有限公司;LB肉湯培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司;限制性內切酶KpnI/XhoI 生工生物工程(上海)股份有限公司;質粒提取試劑盒 杭州寶賽生物科技有限公司;DNA Marker 上海少辛生物科技有限公司;氨芐青霉素 南京凱基生物科技發展有限公司;IPTG 美國AMRESCO公司;Ni Sepharose High Performance填料 GE Healthcare公司;預染蛋白Marker Page Ruler Prestained Protein Ladder 美國Thermo公司;Anti-6×His多克隆兔抗體 HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG 生工生物工程(上海)股份有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術公司。其他試劑均為國產分析純。

恒溫培養搖床 上海一恒科技有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;EPS300電泳儀,VE186轉移電泳槽 上海天能科技有限公司;微生物生長曲線自動分析儀 芬蘭Bioscreen公司;低溫生物冷凍凍干臺 英國林克曼科學儀器公司;CCD攝像機 美國Roper Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1SerD絲膠肽表達質粒的構建SerD是一種含有76個氨基酸的兩個重復序列的絲膠肽。SerD的氨基酸和相應的DNA序列列于表1。

含有KpnI和XhoI酶切位點序列的SerD全長DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將SerD基因插入經KpnI和XhoI酶切過的Pet32a載體中,獲得的質粒被命名為Pet32a-SerD。將該質粒轉化到DH5α菌株中進行增殖。然后從DH5α陽性菌株中提取Pet32a-SerD質粒,并經KpnI/XhoI酶切和DNA測序進行鑒定。

1.2.2 大腸桿菌表達載體的電擊轉化 通過熱沖擊將Pet32a-SerD質粒轉化入大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)中。取1.0 μL重組的Pet32a-SerD質粒轉化BL21(DE3)菌株,42 ℃熱擊90 s,冰上靜置5 min。取適量菌液涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上,37 ℃培養1～2 d,進行轉化平板的篩選和陽性質粒轉化菌株的確定。篩選獲得的陽性質粒轉化菌株命名為BL21-SerD。挑取轉化后平板上的單菌落于試管中,37 ℃、220 r/min培養12 h。提取陽性轉化質粒,采用KpnI/XhoI雙酶切鑒定目的基因的表達,并將重組質粒送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序鑒定。

使用同樣條件轉化空載體Pet32a質粒并于LB瓊脂平板上進行培養,作為空載體陰性對照,篩選的陰性菌株命名為PBL空載菌。

1.2.3 His-SerD融合蛋白的表達、純化和免疫印跡分析 從含有100 μg/mL氨芐青霉素的瓊脂平板上挑選陽性單克隆菌落,接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的4 mL LB培養基中,在37 ℃下震蕩孵育過夜12 h。按1∶100的比例將上述培養基接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的4 mL LB培養基中,繼續在37 ℃孵育,當在600 nm下的光密度達到0.6時,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG。將上述培養基在20 ℃下220 r/min震蕩孵育16 h,然后6000 r/min,4 ℃離心10 min收集菌體細胞,并重懸于裂解緩沖液中(2 mol/L尿素,50 mmol/L Tris,300 mmol/L NaCl,1 mmol/L DTT,0.01%溶菌酶,0.2% TritonX-100,pH8.0)。在冰浴中超聲裂解細胞,功率為400 W,共20 min(工作3 s,間隔5 s)。然后在12000 r/min,4 ℃離心10 min,上清液做進一步純化。

將上述細胞上清液直接加載到HisSep Ni-NTA瓊脂糖柱。經洗滌緩沖液(2 mol/L尿素,50 mmol/L Tris,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑,pH8.0)洗柱后,用洗脫緩沖液梯度洗脫His-SerD融合蛋白(2 mol/L尿素,50 mmol/L Tris,300 mmol/L NaCl,咪唑濃度梯度分別為20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L,pH8.0),流速均為2 mL/min,收集洗脫液。經BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白濃度后,利用SDS-PAGE鑒定His-SerD融合蛋白的純化洗脫濃度。

取40 μL純化后的蛋白樣品,加入10 μL 5×電泳上樣緩沖液,在100 ℃沸水浴5 min,12000 mmol/L離心2 min,然后進行SDS-PAGE(12%聚丙烯酰胺凝膠)。隨后在4 ℃下90 min轉移到聚偏氟乙烯膜。轉膜完成后用含5%脫脂牛奶的PBS+吐溫-20(PBST)封閉膜,然后用Anti-6×His多克隆兔抗體在37 ℃下孵育60 min。經PBST洗膜三次后,用HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG二抗孵育60 min。利用增強型化學發光觀察目標印記片段。

1.2.4 His-SerD融合蛋白的抗凍活性分析

1.2.4.1 表達His-SerD融合蛋白的大腸桿菌冷凍后生長曲線的測定 選擇BL21-SerD誘導重組菌和PBL空載菌為研究對象,進行抗冷凍脅迫活性功能的研究。在上述表達條件下培養待測菌株,至穩定生長初期,6000 r/min,4 ℃,10 min,離心收集菌體細胞。與培養基等量的超純水重懸菌體細胞,制備菌懸液。分別取10 mL樣品菌懸液置于-20 ℃冷凍9 d后取出,37 ℃解凍10 min,然后進行冷凍脅迫后的活性測定。首先利用超純水調整PBL空載菌與BL21-SerD誘導重組菌的OD值接近,然后分別取1 mL菌懸液與滅過菌的含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基按1∶2的濃度制備最終樣品,充分震蕩后取200 μL樣品于微生物100孔板中,每個樣品平行對照三組。采用微生物生長曲線自動分析儀測定樣品的生長曲線。檢測溫度37 ℃,波長600 nm,靜置檢測,周期為48 h,平均每2 h檢測一次。

1.2.4.2 重結晶抑制活性的測定 在兩蓋玻片之間加入5 μL PBS緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,pH8.0)作為對照,或含0.53 mg/mL His-SerD融合蛋白的PBS緩沖液樣品。采用低溫臺以液氮供冷的方式對蓋玻片上的樣品進行凍結,并連接一個配備CCD攝相機的Olympus BX41顯微鏡。樣品以30 ℃/min的速度快速冷卻到-50 ℃,在此溫度下維持1 min,再以30 ℃/min的速度升溫到-6 ℃,在此溫度下維持30 min。在此期間,以1280×1024像素進行顯微拍攝,具體的拍攝時間間隔為10 min。通過記錄在不同冷凍時間下冰晶的大小和數量的變化測定His-SerD融合蛋白對冰重結晶的影響。

1.3 數據處理

以上實驗均重復3次,結果以平均值±標準差表示。利用Origin作圖軟件,并采用SPSS分析數據顯著性。

2 結果與分析

2.1 Pet32a-SerD重組質粒的構建及鑒定

SerD的基因長度為258 bp,包括ORF基因228 bp,限制性內切酶位點12 bp,腸激酶位點15 bp和終止子3bp。合成的SerD基因的目標DNA長度約為250 bp(圖1)。用KpnI和XhoI酶切PCR產物及載體Pet32a,然后經連接獲得重組質粒Pet32a-SerD。為了鑒定SerD基因是否插入到Pet32a中,利用特定的限制性內切酶KpnI和XhoI雙酶切Pet32a-SerD,并進行DNA測序。KpnI和XhoI的雙酶切結果表明SerD基因含有目標DNA條帶(圖2)。利用NCBI BLAST工具進行DNA測序,Pet32a-SerD的DNA序列為BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。DNA測序結果表明,陽性菌落質粒與目的基因密碼子核苷酸序列吻合度達到100%,即Pet32a-SerD的DNA序列與SerD基因完全匹配(圖3)。上述鑒定結果均一致表明,根據之前的設計目的基因已成功重組到Pet32a中。

圖1 SerD基因片段Fig.1 Target fragments of SerD gene注:1表示SerD基因片段;M表示#SM331 GeneRuler DNA Ladder Mix。

圖2 Pet32a-SerD重組質粒的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid Pet32a-SerD by double-enzyme digestion注:1表示Pet32a;M表示GeneRuler DNA Ladder Mix。

圖3 Pet32a-SerD重組質粒的DNA測序Fig.3 DNA sequencing of recombinant plasmid Pet32a-SerD

2.2 His-SerD融合蛋白的誘導、表達和純化

將Pet32a-SerD質粒轉化到表達宿主BL21(DE3)中,獲得重組菌BL21-SerD。采用兩種不同的誘導條件(20 ℃,6 h和37 ℃,4 h)優化His-SerD融合蛋白的表達。經IPTG誘導后,將細胞裂解并溶于PBS緩沖液中,利用SDS-PAGE檢測重組蛋白。在SDS-PAGE結果中(圖4),可觀察到經誘導表達的重組菌電泳通道處有明顯條帶出現,而在相同位置處,未誘導菌全液處未見明顯條帶,該結果證明 His-SerD融合蛋白在重組菌中表達成功。此外,還可以進一步判斷得到在20 ℃下誘導16 h比37 ℃誘導4 h更有效(圖4)。對最優誘導表達條件下的重組菌再次進行SDS-PAGE檢測,結果表明,表達的重組蛋白的分子量在25～35 kDa(圖5a),這是因為在His-SerD融合蛋白中,除了SerD肽(～10 kDa)之外,還有Trx標記(～12 kDa),His標記(～1 kDa),S標記(～2 kDa),腸激酶酶切位點(～1 kDa)和凝血酶酶切位點(～1 kDa)。Western blot證明了His-SerD融合蛋白的表達(圖5b)。

圖4 SDS-PAGE優化His-SerD融合蛋白的表達條件Fig.4 SDS-PAGE optimized expression conditions of His-SerD fusion protein注:M表示Protein Marker;1表示未誘導菌全液; 2表示20 ℃誘導菌上清液;3表示20 ℃誘導菌沉淀; 4表示37 ℃誘導菌上清液;5表示37 ℃誘導菌沉淀。

圖5 SDS-PAGE(a)和Western blot(b)鑒定His-SerD融合蛋白的表達Fig.5 SDS-PAGE(a)and Western blot(b) identified the expression of His-SerD fusion protein

采用鎳瓊脂糖親和層析純化大腸桿菌表達的His-SerD融合蛋白,確定咪唑的洗脫濃度。SDS-PAGE鑒定洗脫液中的His-SerD融合蛋白,比較20、40和60 mmol/L咪唑洗脫,His-SerD融合蛋白的條帶清晰度及顯著度依次增加,故目標蛋白的最佳洗脫濃度為60 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(圖6)。

圖6 SDS-PAGE鑒定His-SerD融合蛋白的純化洗脫液濃度Fig.6 SDS-PAGE identified the concentration of purified elution buffer for His-SerD fusion protein注:M表示Protein Marker;1表示20 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液;2～4表示40 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液;5～9表示60 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液。

2.3 表達His-SerD融合蛋白的大腸桿菌冷凍后的生長曲線

經過冷凍脅迫處理后菌體細胞的生長速率是評價細胞冷凍脅迫抗性的一個指標[17-18]。選取BL21-SerD誘導重組菌和PBL空載菌作為研究對象,對待測菌株重培養過程中細胞的生長情況進行了測定。冷凍脅迫處理后,兩個研究對象表現出了一定的生長速率差異。具體結果如圖7所示,在-20 ℃經過9 d的低溫冷凍脅迫處理后,胞內表達His-SerD融合蛋白的大腸桿菌菌株(BL21-SerD)復蘇后的生長活性明顯高于未表達His-SerD融合蛋白的大腸桿菌菌株(PBL)。在對數生長后期,未表達His-SerD融合蛋白的大腸桿菌菌株(PBL)的生長速率也明顯減緩。上述結果表明,His-SerD融合蛋白的表達可以提高菌株細胞抗冷凍脅迫性的作用。這對提高冷凍脅迫后菌體細胞的活力特別是改善工業生產中因起始菌株的低溫保藏造成的生產效率的下降具有重要意義。

圖7 冷凍脅迫后大腸桿菌的生長曲線Fig.7 Growth curve of E.coli after freezing stress

2.4 His-SerD融合蛋白的重結晶抑制活性

在凍結的生物組織和冷凍食品中發現的冰重結晶,是一個較小冰晶長成較大冰晶的過程,進而導致細胞內冰晶的形成和生長,這通常會對組織具有不利的影響[19-20]。在冷凍溶液中添加可以抑制冰重結晶、維持小冰晶形態的抗凍肽,具有巨大的醫療、商業和工業應用價值[21-22]。通過觀察添加或不添加His-SerD融合蛋白的冷凍PBS緩沖液中冰晶的大小和形狀來證明His-SerD融合蛋白具有抑制冰重結晶的能力。研究結果表明,在30 min孵育期間,與對照PBS溶液中形成的大且圓形的冰晶相比,在含0.53 mg/mL His-SerD融合蛋白的溶液中形成的冰晶具有更小的和更不規則的形狀(圖8)。因此,研究結果證明His-SerD融合蛋白的添加明顯降低了冰晶顆粒的大小,表明其具有較好的重結晶抑制效果。

圖8 His-SerD融合蛋白的重結晶抑制效果分析圖Fig.8 Analysis of recrystallization inhibition effect of His-SerD fusion protein

3 結論

本文通過基因工程方法,成功構建了一種絲膠抗凍肽(SerD)在大腸桿菌中的重組表達系統。研究結果表明,His-SerD融合蛋白的表達適宜條件為20 ℃下誘導16 h;SDS-PAGE和Western-Blot鑒定His-SerD融合蛋白表達的分子量在25～35 kDa之間;His-SerD融合蛋白在鎳瓊脂糖親和層析純化分離過程中最佳的洗脫濃度為60 mmol/L咪唑濃度的洗脫緩沖液。經過9 d的-20 ℃低溫冷凍脅迫處理后,胞內表達His-SerD融合蛋白的大腸桿菌菌株BL21-SerD復蘇后的生長活性明顯高于PBL空載大腸桿菌。此外,His-SerD融合蛋白的添加明顯降低了溶液中冰晶顆粒的大小,表現出較好的重結晶抑制效果。以上研究結果表明,His-SerD融合蛋白具有抗冷凍脅迫保護作用,在冷凍食品加工中具有一定的應用前景。