木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的提取工藝優化及穩定性研究

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(北京林業大學生物科學與技術學院,食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 10083)

木鱉果(Momordicacochinchinensis)為葫蘆科苦瓜屬草本植物,原產于東亞和東南亞地區,在中國主要分布于南部地區[1],是迄今為止發現的β-胡蘿卜素含量最高的水果[2]。目前,國外研究者對木鱉果中功能成分的種類、含量進行了廣泛的研究,發現木鱉果果肉中番茄紅素與β-胡蘿卜素含量雖僅有0.380～0.408、0.083～0.769 mg/g[3],但其在假種皮中含量豐富,故被譽為“來自天堂的水果”[4-5]。同時其假種皮中還含有豐富的維生素E以及ω-3-脂肪酸[6],對于開發木鱉果類新型產品有極其重要的作用。而我國對于木鱉果的研究尚處于起步階段,針對木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的提取工藝以及性質等的研究更是一片空白。人們對木鱉果的營養價值認識不足,僅利用其提取色素制糯米飯或提取木鱉果油[7],其中含量很高的類胡蘿卜素物質未被充分利用,且木鱉果中β-胡蘿卜素在食品應用中仍存在一些問題[8]有待深入研究。

β-胡蘿卜素(C40H56)是一種紅紫至暗紅色、有光澤的斜六面體或結晶性粉末,有輕微異臭或異味,不溶于水,難溶于甲醇、丙二醇、酸和堿,易溶于二硫化碳、氯仿、乙烷及植物油[9-10],具有高維生素A原活性和強抗氧化特性[11],廣泛應用于食品體系中。β-胡蘿卜素作為一種強抗氧化劑,具有高效猝滅單線態氧和清除自由基的作用。它不但具有防癌抗癌、防輻射抗衰老的特點,而且還可以清除香煙和汽車廢氣中的有毒物質。由于天然β-胡蘿卜素具有合成品沒有的特性[12-17],它廣泛應用于食品著色、營養保健、藥品及飼料四大領域[18-19]。因此,如何高效地從天然植物中提取β-胡蘿卜素有十分重要的研究意義。

本文以木鱉果假種皮為原料,運用超聲輔助乙醇提取法,探究其提取β-胡蘿卜素的最佳工藝,并通過L9(34)正交實驗對提取工藝參數進行優化,同時對木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的穩定性進行研究,為木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素在食品加工中的應用以及綜合利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

木鱉果 中國廣西壯族自治區南寧市;β-胡蘿卜素 標準品,上海阿拉丁生化科技有限公司;無水乙醇 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉 分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司。

GX-03 150型克多功能粉碎機 浙江高鑫工貿有限公司;LQ-A30002型電子天平 瑞安市樂祺貿易有限公司;KQ-100DE型超聲破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司;L3660D型低速離心機 上海知信實驗儀器有限公司;UV-6100型紫外分光光度儀 上海元析儀器有限公司;GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 木鱉果假種皮β-胡蘿卜素的提取工藝 采用敖艷等[20]的方法提取β-胡蘿卜素,方法略作修改。提供工藝流程如下:

木鱉果→去皮取假種皮→40 ℃干燥4 h去核→40 ℃干燥至恒重→粉碎、過60目篩→超聲輔助提取木鱉果假種皮β-胡蘿卜素→離心過濾→取上清液即為類胡蘿卜素提取液

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 超聲功率對β-胡蘿卜素提取量的影響 準確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲時間為45 min,超聲溫度為55 ℃,料液比為1∶15 g/mL條件下,以不同超聲功率(50、60、70、80、90 W)提取β-胡蘿卜素,測定并計算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.2.2 超聲溫度對β-胡蘿卜素提取量的影響 準確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲功率為70 W,超聲時間為45 min,料液比1∶15 g/mL條件下,以不同超聲溫度(25、35、45、55、65 ℃)提取β-胡蘿卜素,測定并計算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.2.3 超聲時間對β-胡蘿卜素提取量的影響 準確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲功率為70 W,超聲溫度為55 ℃,料液比1∶15 g/mL條件下,以不同超聲時間(15、30、45、60、75 min)提取β-胡蘿卜素,測定并計算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.2.4 料液比對β-胡蘿卜素提取量的影響 準確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲功率為70 W,超聲時間為45 min,超聲溫度為55 ℃條件下,以不同料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL提取β-胡蘿卜素,測定并計算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.3 正交試驗設計 在上述單因素實驗的基礎上,以超聲功率(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)、料液比(D)為考察因素,每個因素選取3個對β-胡蘿卜素提取量影響較大的水平,進行L9(34)正交優化實驗。以β-胡蘿卜素提取量為評價指標,對從木鱉果假種皮中提取β-胡蘿卜素的提取工藝進行優化。

1.2.4β-胡蘿卜素含量的測定β-胡蘿卜素標準曲線的繪制:準確稱量0.0125 gβ-胡蘿卜素標準樣品,溶于無水乙醇中,定容至50 mL,制得β-胡蘿卜素標準液。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標準液,用無水乙醇定容至25 mL,使其濃度分別達到1、2、3、4、5 μg/mL,于451 nm處測定吸光值,以吸光值為縱坐標,標準β-胡蘿卜素濃度為橫坐標繪制標準曲線,根據標準曲線和樣品所測吸光值,求得各處理提取液濃度。

根據翟丹云等[21]的方法測定木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的含量,方法略作修改。

式(1)

其中:C-β-胡蘿卜素濃度(μg/mL);V-提取液的體積(mL);B-稀釋倍數;M-稱取木鱉果假種皮粉的質量(g)。

1.2.5β-胡蘿卜素的純化 實驗中β-胡蘿卜素的浸提劑為乙醇,因此在色素中不可避免混入了一部分醇溶蛋白。為了進一步提高β-胡蘿卜素的純度,調節pH使其達到蛋白質的等電點并沉淀,離心過濾除去醇溶蛋白。采用劉緒廣等[22]的方法除去提取液中的醇溶蛋白,方法略作修改。準確量取木鱉果假種皮色素醇溶液100 mL,用0.05 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液調節溶液pH,當pH調至6左右時溶液產生沉淀。隨后將其放置在-15 ℃的冰箱中,冷凍12 h,肉眼可見溶液中大量絮狀物沉淀,采用離心機轉速4000 r/min離心10 min除去該沉淀,從而得到純度較高的β-胡蘿卜素澄清液。

1.2.6β-胡蘿卜素穩定性實驗

1.2.6.1 光照對β-胡蘿卜素保留率的影響 采用敖艷等[20]的方法研究光照對β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05%的木鱉果假種皮色素醇溶液,將其分別置于室外自然光及暗處,每隔24 h測定溶液的吸光值A,根據公式(2)計算保留率,研究光照對木鱉果假種皮色素的影響。

式(2)

其中:A-樣品吸光值;A0-對照組吸光值。

1.2.6.2 溫度對β-胡蘿卜素保留率的影響 采用申海進等[23]的方法研究溫度對β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05%的木鱉果假種皮色素醇溶液,分別置于4、20、50、75、100 ℃的溫度條件下,每隔1 h測定溶液的吸光值A,根據公式(2)計算保留率,研究溫度對木鱉果假種皮色素的影響。

1.2.6.3 pH對β-胡蘿卜素保留率的影響 采用申海進等[23]的方法研究pH對β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0),使各緩沖液中色素濃度為0.05%,放置4 ℃冰箱中,每隔1 h測定溶液的吸光值A,根據公式(2)計算保留率,研究pH對木鱉果假種皮色素的影響。

1.2.6.4 不同金屬離子對β-胡蘿卜素保留率的影響 采用申海進等[23]的方法研究離子對β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05%的木鱉果假種皮色素醇溶液,分別加入濃度為0.05、1.0 mol/L的Fe3+、Fe2+、Zn2+、Na+、K+、Cu2+溶液,放置4 ℃冰箱中,24 h后測定吸光值A,根據公式(2)計算保留率,研究金屬離子對木鱉果假種皮色素的影響。

1.3 數據處理

采用Excel軟件進行單因素實驗和穩定性實驗數據處理;SPSS Statistics 22.0進行極差和方差分析。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標準曲線

β-胡蘿卜素標準曲線如圖1所示,方程為y=0.097x+0.045,R2=0.9992,擬合度較好,可用于測定β-胡蘿卜素含量。

圖1 β-胡蘿卜素標準曲線Fig.1 Standard curve of β-carotene

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 超聲功率對β-胡蘿卜素提取量的影響 超聲功率對β-胡蘿卜素的提取量影響如圖2所示。由圖2可知,β-胡蘿卜素提取量隨著超聲功率的增大呈現先增大后減小的趨勢。β-胡蘿卜素提取量在超聲功率為70 W時最高,達到1.542 mg/g。可能的原因是隨著超聲功率的增大,空化作用增強,有利于β-胡蘿卜素溶出;而超聲功率在達到70 W之后色素基本上已經溶出,提取量不再上升。因此,選擇超聲功率70 W為適宜功率。

圖2 超聲功率對β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on β-carotene extraction

2.2.2 超聲溫度對β-胡蘿卜素提取量的影響 超聲溫度對β-胡蘿卜素的提取量影響如圖3所示。當溫度在25～55 ℃范圍內時,隨著溫度的升高,β-胡蘿卜素提取量增加;當提取溫度為55 ℃時,β-胡蘿卜素提取量最高,為1.823 mg/g。而溫度達到55 ℃以上時,β-胡蘿卜素提取量隨著溫度的升高而急劇降低,可能的原因是β-胡蘿卜素在溫度較高的條件下不穩定,易降解[24]。因此,選擇55 ℃為適宜提取溫度。

圖3 提取溫度對β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.3 Effect of temperature on β-carotene extraction

2.2.3 超聲時間對β-胡蘿卜素提取量的影響 超聲時間對β-胡蘿卜素的提取量影響如圖4所示。由圖4可以看出,超聲時間對β-胡蘿卜素提取量的影響較小,在15～75 min中稍有波動,超聲時間為45 min時,β-胡蘿卜素提取量較高,為1.475 mg/g。提取時間45、60 min時β-胡蘿卜素提取量變化不大;隨著時間增加,β-胡蘿卜素提取量下降,推測原因可能是本實驗在較高溫度下(55 ℃)提取β-胡蘿卜素,而長時間加熱會對β-胡蘿卜素造成破壞,為了保證提取到的β-胡蘿卜素含量更高,應選取較短時間提取β-胡蘿卜素。因此,本實驗選取45 min為適宜提取時間。

圖4 提取時間對β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.4 Effect of time on β-carotene extraction

2.2.4 料液比對β-胡蘿卜素提取量的影響 料液比對β-胡蘿卜素的提取量影響如圖5所示。由圖5可知,料液比從1∶5～1∶25 g/mL之間,β-胡蘿卜素的提取量隨著料液比的增大呈現先增加后趨于平穩的趨勢。當料液比達到1∶15 g/mL時,假種皮中β-胡蘿卜素的提取量最高,達到1.423 mg/g。可能的原因是隨著料液比的增大,β-胡蘿卜素的提取量升高,當料液比大于1∶15 g/mL時,溶出的脂溶性雜質成分可與乙醇結合,導致β-胡蘿卜素提取量不再上升。所以確定假種皮β-胡蘿卜素的適宜提取料液比為1∶15 g/mL。

圖5 料液比對β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on β-carotene extraction

2.3 正交試驗結果

從表2的極差分析結果可以看出,RC>RD>RA>RB,因此4個因素對超聲波輔助乙醇提取β-胡蘿卜素的效果影響的大小順序為:超聲溫度(C)>料液比(D)>超聲功率(A)>超聲時間(B)。其中,超聲溫度F值>F0.01,對提取量影響極顯著,料液比F值>F0.05,對提取量影響顯著;超聲功率以及超聲時間對提取量影響不大。在實驗設計范圍內,優化得到超聲波輔助乙醇提取β-胡蘿卜素的最佳條件為A1B3C3D3,即超聲功率60 W、超聲時間60 min、超聲溫度65 ℃、料液比1∶20 g/mL。

表2 L9(34)正交試驗設計及結果Table 2 L9(34)orthogonal array design and results

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Variance results of orthogonal test analysis

2.4 驗證試驗

以2.3中正交試驗得出的最佳條件為基礎進行驗證試驗,通過計算得到的β-胡蘿卜素提取量約為(2.212±0.075) mg/g,高于正交表中試驗結果,說明采用正交法得到的優化工藝可行性強,優化結果可靠。

2.5 穩定性實驗結果

2.5.1 光照對β-胡蘿卜素穩定性的影響 光照對β-胡蘿卜素穩定性的影響如圖6所示。由圖6可知,在避光條件下β-胡蘿卜素保留率在100%左右波動,穩定性較好。但是在光照條件下,隨著時間的增加β-胡蘿卜素不斷降解,保留率顯著下降,在第5 d時保留率僅為15.28%。這說明β-胡蘿卜素在強烈日光照射下極不穩定。通過對比可知,光照會使β-胡蘿卜素的降解速率增加。總體來看,避光條件下有利于β-胡蘿卜素的保存。

圖6 光照對β-胡蘿卜素穩定性的影響Fig.6 Effect of light on stability of β-carotene

2.5.2 溫度對β-胡蘿卜素穩定性的影響 溫度對β-胡蘿卜素穩定性的影響如圖7所示。圖7中結果顯示,在4、25 ℃條件下,β-胡蘿卜素的保留率在100%上下波動,波動較小;在50 ℃條件下,β-胡蘿卜素的保留率稍有增加,這可能是在加熱過程中溶出了其他顯色色素;而在100 ℃下,β-胡蘿卜素保留率明顯降低,在第6 h保留率為71.37%。總體來看,β-胡蘿卜素不耐高溫,對低溫及室溫有較強的耐受性。因此低溫或室溫條件是保存β-胡蘿卜素的有利條件。

圖7 溫度對β-胡蘿卜素穩定性的影響Fig.7 Effects of temperature on stability of β-carotene

2.5.3 pH對β-胡蘿卜素穩定性的影響 pH對β-胡蘿卜素穩定性的影響如圖8所示。由圖8可知,在酸性條件下(pH為3.0、4.0、5.0、6.0),β-胡蘿卜素的保留率較高,隨著時間的增加趨于穩定,約為110.00%;在堿性和中性條件下,保留率明顯下降,反應2 h后達到60.00%左右并保持穩定。實驗中觀察到在堿性環境(pH為8.0)時溶液中迅速產生大量黃色絮狀沉淀,這說明β-胡蘿卜素在堿性條件下沉降,而在測定吸光度時主要顯色物質是β-胡蘿卜素,因此吸光度減小。

圖8 pH對β-胡蘿卜素穩定性的影響Fig.8 Effects of pH on stability of β-carotene

2.5.4 不同金屬離子對β-胡蘿卜素穩定性的影響 離子對β-胡蘿卜素穩定性的影響如表4所示。由表4可知,Na+、K+對木鱉果假種皮β-胡蘿卜素的穩定性影響不大,12 h內β-胡蘿卜素的保留率均約等于100%,溶液顏色穩定呈淺黃色、稍有渾濁,而其余離子對假種皮β-胡蘿卜素穩定性均有一定的影響。加入Fe3+后,β-胡蘿卜素的保留率明顯增加,提取液顏色呈黃偏褐色,這可能是因為Fe3+本身的顏色使得溶液黃色更深,表現為吸光值明顯增大。而在Fe2+、Cu2+溶液環境中,保留率降低,且隨著濃度的增加,保留率更小。在Zn2+存在條件下,保留率急劇降低,在0.1 mol/L時降低至29.96%,在提取液顏色變淺的同時迅速形成大量沉淀,本實驗研究結果與文獻報道相似[24]。

表4 金屬離子對β-胡蘿卜素穩定性的影響Table 4 Effect of metal ions on stability of β-carotene

3 結論

采用超聲波輔助乙醇提取木鱉果假種皮中的β-胡蘿卜素時,最佳提取條件為超聲功率60 W、超聲時間60 min、超聲溫度65 ℃、料液比1∶20 g/mL,此條件下的提取量為(2.212±0.075) mg/g。

在穩定性實驗研究中得出β-胡蘿卜素對光照、溫度、酸堿環境、離子較為敏感。β-胡蘿卜素受光照、高溫影響較大,在光照和100 ℃下降解較快,因此避光、低溫或室溫是保存β-胡蘿卜素的有利條件。酸性條件對β-胡蘿卜素有增色作用,保留率升高;而在堿性條件下,β-胡蘿卜素發生沉降,保留率降低,因此要避免在強酸強堿環境下保存β-胡蘿卜素。Fe3+對β-胡蘿卜素有增色作用,而Fe2+、Zn2+、Cu2+對其有不同程度的減色作用,尤其在Zn2+存在條件下,β-胡蘿卜素特別不穩定,產生大量絮狀沉淀,溶液淺黃接近無色,而在Na+、K+環境下則有利于其儲存。