抗赭曲霉毒素A五價納米抗體的表達及分析

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(1.南昌大學食品學院,江西南昌 330047; 2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047; 3.南昌大學，中德聯合研究院,江西南昌 330047)

赭曲霉毒素(ochratoxin)是由曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)的某些種產生的次級代謝產物,包含7種結構類似的化合物[1-2]。其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最強,具有腎臟毒性、肝臟毒性及致畸、致癌和致突變等特性[3-4]?；魜y毒素B亞基(B subunit of Cholera toxin,CTB)通過最近鄰相互作用形成自組裝五元環狀結構[5],通常被作為免疫佐劑,將抗原與其融合表達來提高免疫原性[6]。納米抗體(nanobody,Nb)又被稱為單域重鏈抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain)[7],由天然缺失輕鏈的重鏈可變區構成,是自然存在的可與抗原結合的最小片段[8],具有分子質量小、易改造、易于表達以及穩定性好等優點[9-12]。納米抗體現已被廣泛的應用于醫學診斷、藥物開發、食品安全檢測等方面[13-15]。結合基因工程技術可得到不同形式的納米抗體,如多價納米抗體[16]、融合型納米抗體[17]、多特異性納米抗體[18]等均有報道,相比其他抗體,經過改造攜帶特定結構的納米抗體具有更加明顯的優勢。在前期工作中,實驗室已成功構建出pET-CTB-VHH28原核表達載體。本研究主要將該重組載體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中進行原核表達,利用CTB自組裝形成五聚體結構，從而將納米抗體VHH28多聚化。通過優化表達條件從而得到可溶性的融合蛋白CTB-VHH28,并對其活性及穩定性進行初步分析,為后續建立檢測OTA方法提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組載體pET-CTB-VHH28、表達菌株EscherichiacoliBL21(DE3) 均由本實驗室保存;人工抗原OTA-BSA 由本實驗室制備;OTA 美國Sigma-Aldrich 公司;HisTrapTMHP預裝柱(1 mL)、兔抗 HIS[HRP]多克隆抗體 美國GE公司;異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG) 美國Thermo Fisher公司,三(羥甲基)氨基甲烷,3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑與藥品 均為國產分析純。

酶聯免疫分析儀(Multiscan FC)、低溫高速離心機(Multifuge X1R) 美國Thermo公司;Millipore超純水儀 美國Millipore公司;恒溫搖床 上海智城公司;DYY-I III瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠;JY92-IIDN超聲波細胞破碎儀 寧波新藝超聲設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CTB-VHH28誘導條件的確定 通過將重組載體PET-CTB-VHH28轉化至E.coliBL21(DE3)中,成功表達出OTA五價納米抗體,分子量大小約150 kDa。為了得到純度較高的五價納米抗體及提高蛋白的表達量,本研究對誘導劑用量、誘導溫度及誘導時間三個主要因素進行了優化。

1.2.1.1 誘導劑IPTG濃度的確定 將37 ℃、220 r/min培養12 h的含有質粒pET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養至菌液OD600=0.6～0.8,加入不同濃度的IPTG(終濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mmol/L),20 ℃、180 r/min誘導表達12 h,取樣10 μL,加入蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.1.2 誘導溫度的確定 將37 ℃、220 r/min培養12 h的含有質粒PET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養至菌液OD600=0.6～0.8,加入誘導劑IPTG(終濃度為0.05 mmol/L),分別在16、20、25 ℃下,180 r/min誘導表達12 h,取樣10 μL,加入蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.1.3 誘導時間的確定 將37 ℃、220 r/min培養12 h的含有質粒pET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養至菌液OD600=0.6～0.8,加入誘導劑IPTG(終濃度為0.05 mmol/L),16 ℃、180 r/min分別表達2、4、6、8、10、12 h,取樣10 μL,加入蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.2 納米抗體CTB-VHH28聚合情況的分析 將37 ℃、220 r/min培養12 h的含有質粒pET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養至菌液OD600=0.6～0.8,加入誘導劑IPTG(終濃度為0.05 mmol/L),16 ℃、180 r/min誘導表達10 h,收集菌體,磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗菌體,離心收集菌體,重懸至PBS中,超聲破碎,收集上清,過Ni柱純化,分別用含有20、50、100 mmol/L咪唑的緩沖溶液依次清洗柱體,洗去雜蛋白,含有200 mmol/L咪唑的緩沖液將目的蛋白洗脫,收集洗脫的目的蛋白,用1×PBS 4 ℃透析,每隔8 h更換一次透析液,透析24 h,分別取透析后的樣品各10 μL,分別加入含有β-巰基乙醇的上樣緩沖液加熱變性和不含β-巰基乙醇的上樣緩沖液,SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 間接ELISA測定納米抗體CTB-VHH28效價 100 μL/孔人工抗原OTA-BSA(2 μg/mL)加入酶標板4 ℃包被過夜,PBST洗板3次,300 μL/孔4%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h,PBST洗板3次,100 μL/孔不同稀釋倍數(分別稀釋400、800、1600、3200、6400、12800倍)的納米抗體CTB-VHH28,37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔HIS二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔TMB顯色液37 ℃顯色8 min,50 μL/孔終止液終止反應,測定OD450。

1.2.4 CTB-VHH28間接競爭ELISA標準曲線的繪制 100 μL/孔人工抗原OTA-BSA(2 μg/mL)加入酶標板4 ℃包被過夜,PBST洗板3次,300 μL/孔4%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h,PBST洗板3次,50 μL/孔納米抗體CTB-VHH28和50 μL/孔不同濃度的OTA標準品(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 ng/mL),37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔HIS二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔TMB顯色液37 ℃顯色8 min,50 μL/孔終止液終止反應,測定OD450。以結合率(B/B0,%)=[(競爭抗原孔OD450值-空白對照OD450值)/非競爭抗原孔 OD450值]×100為縱坐標,使用邏輯斯蒂方程(y=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)^p)擬合繪制CTB-VHH28-ELISA競爭抑制曲線。

1.2.5 納米抗體CTB-VHH28特異性分析 分別配制工作濃度(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 ng/mL)的黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)標準品代替OTA標準品進行間接競爭ELISA繪制相應的競爭抑制曲線,計算其 IC50及交叉反應率(Cross Reactivity,CR)。CR(%)=[IC50(OTA)/IC50(AFB 1/ZEN/DON)]× 100。

1.2.6 納米抗體CTB-VHH28熱穩定性分析 取純化透析后的CTB-VHH28分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃下孵育10 min,迅速冰浴5 min,取樣10 μL,加入不含有β-巰基乙醇的上樣緩沖液,上樣進行SDS-PAGE電泳，分析溫度對CTB-VHH28結構的影響。取純化透析后的CTB-VHH28分別在25、35、45、55、65、75、85、95 ℃下孵育10 min,采用間接ELISA分析不同溫度處理的CTB-VHH28抗原結合活性。取純化后CTB-VHH28分別置于35、55、75 ℃三種溫度下,分別作用10、20、30、40、50、60 min,以剩余活性(%)=(加熱處理的CTB-VHH28 OD450/未處理的CTB-VHH28 OD450)×100%為縱坐標,分析CTB-VHH28熱穩定性。

1.2.7 甲醇濃度對納米抗體CTB-VHH28的影響 配制體積分數為2.5%、5%、10%、20%、40%甲醇-PBS緩沖液稀釋OTA標準品至不同的工作濃度(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 ng/mL),納米抗體CTB-VHH28的工作濃度為0.06 μg/mL,間接競爭ELISA分析不同甲醇濃度對納米抗體CTB-VHH28的靈敏度的影響,繪制CTB-VHH28競爭抑制曲線。

1.3 數據統計分析

數據統計分析采用Origin 8.0軟件,對數據進行非線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 誘導劑IPTG濃度的確定

如圖1所示,誘導劑IPTG的濃度為0.02 mmol/L時,CTB-VHH28蛋白的表達量最低,其他濃度IPTG對CTB-VHH28的表達量沒有明顯的影響。IPTG作為一種強誘導劑,在菌體中不能夠被代謝,可以持續地發揮作用,所以少量的IPTG就可以起到很好的誘導效果[19]。所以選擇終濃度為0.05 mmol/L的IPTG作為最佳的誘導劑濃度。

圖1 IPTG濃度對CTB-VHH28表達的影響Fig.1 Effect of IPTG concentration on the expression of CTB-VHH28注:M:廣譜蛋白Marker;1:未加入IPTG的菌體總蛋白; 2～6:IPTG濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、 0.5 mmol/L誘導后的菌體總蛋白。

2.2 誘導溫度的確定

誘導溫度不僅影響菌體的生長,同樣影響著重組蛋白的誘導表達及蛋白的可溶性。很多蛋白在溫度較高條件下誘導表達時容易出現錯誤性折疊,從而形成包涵體沉淀,而低溫誘導可以有助于蛋白的可溶性表達及形成正確的結構[20],如圖2所示,在16、20、25 ℃三種溫度下誘導表達的蛋白量基本一致,故選取溫度更低的16 ℃為納米抗體CTB-VHH28最佳的誘導表達溫度,以實現可溶性表達及形成正確結構。

圖2 誘導溫度對CTB-VHH28表達的影響Fig.2 Effect of induction temperature on the expression of CTB-VHH28注:M：廣譜蛋白Marker;1：誘導前菌體總蛋白; 2～4:分別在16、20、25 ℃下誘導后的菌體總蛋白。

2.3 誘導時間的確定

由圖3可知,納米抗體CTB-VHH28隨著誘導時間的增加,菌液中CTB-VHH28產量呈上升的趨勢,當誘導10 h后,CTB-VHH28表達量沒有明顯的變化,原因可能是隨著誘導時間的增加,菌體產酶逐漸飽和使其表達量不再增加,同時產生的外源蛋白也可能會被菌體產生的蛋白酶降解,使其表達量降低,故而選取10 h為納米抗體CTB-VHH28的最佳誘導時間。

圖3 誘導時間對CTB-VHH28表達的影響Fig.3 Effect of induction time on the expression of CTB-VHH28注:M:廣譜蛋白Marker;1:誘導前菌體總蛋白;2～7:分別誘導表達2、4、6、8、10、12 h后的菌體總蛋白。

2.4 CTB-VHH28聚合情況分析

從圖4中可以得知,菌體破碎上清經過Ni柱純化透析后，得到了較純的納米抗體且以五聚體的形式存在,分子量大約為150 kDa,而經過加熱變性解鏈為單體后的分子量大小約為30 kDa,均與軟件(DNAstar)預測大小相一致。經Nanodrop 1000定量計算得出重組蛋白表達量達20 mg/L。

圖4 CTB-VHH28聚合情況分析Fig.4 The result of CTB-VHH28 pentamer注:M:廣譜蛋白Marker;1:加入含有β-巰基乙醇的上樣Buffer且加熱變性的CTB-VHH28;2:加入不含有β-巰基乙醇上樣Buffer且不加熱的CTB-VHH28。

2.5 納米抗體CTB-VHH28的活性分析

間接ELISA測定納米抗體CTB-VHH28的效價。由表1可知,隨著納米抗體CTB-VHH28稀釋倍數的增加,OD450逐漸減小,說明因反應體系中CTB-VHH28濃度降低,與人工抗原特異性結合的抗體減少,選取顯色值在1.0～1.2左右為最佳,當稀釋6400倍(終濃度為:0.06 μg/mL)為最佳工作濃度。

表1 納米抗體CTB-VHH28效價測定Table 1 The test for potency of CTB-VHH28

間接競爭ELISA分析納米抗體CTB-VHH28活性,繪制CTB-VHH28-ELISA競爭抑制曲線。如圖5所示,當反應體系中OTA標品濃度增加,OD450呈下降的趨勢。結果表明,納米抗體CTB-VHH28與人工抗原OTA-BSA的結合可被競爭抗原OTA抑制且阻斷,顯示其出了良好特異性。在反應體系甲醇濃度為2.5%時,繪制CTB-VHH28-ELISA標準曲線,半數抑制率(IC50)為0.38 ng/mL。

圖5 間接競爭ELISA分析納米抗體CTB-VHH28活性Fig.5 Bioactivity analysis of CTB-VHH28 by indirect competitive ELISA注:A:納米抗體CTB-VHH28與OTA-BSA結合活性;B:CTB-VHH28間接競爭ELISA標準曲線。

2.6 納米抗體CTB-VHH28特異性分析

如圖6所示,納米抗體CTB-VHH28與其他幾種真菌毒素幾乎無交叉反應,均小于1.5%,只與OTA特性結合,具有較高的特異性,可用于OTA的檢測。

圖6 CTB-VHH28與其他真菌毒素的交叉反應率Fig.6 Cross reactivity of CTB-VHH28 with other mycotoxins

2.7 納米抗體CTB-VHH28熱穩定性分析

通過SDS-PAGE初步分析五聚體結構的熱穩定性。如圖7所示,納米抗體CTB-VHH28在30～60 ℃處理5 min后,納米抗體的分子量均為150 kDa,五聚體結構基本沒有被破壞,70 ℃處理5 min后,在30 kDa的位置逐漸出現條帶,且150 kDa的條帶變小,表明五聚體部分解鏈為單體。隨著溫度的升高,當經過90 ℃熱處理5 min后,納米抗體CTB-VHH28全部解鏈為30 kDa單體。納米抗體單體及霍亂毒素B亞基的肽鏈上均存在兩個半胱氨酸。肽鏈上的半胱氨酸殘基的巰基基團能發生氧化反應形成分子內二硫鍵,當加熱溫度過高時，二硫鍵被破壞,導致五聚體結構被破壞為單體[21]。

圖7 溫度對CTB-VHH28五聚體結構的影響Fig.7 Effect of temperature on the pentamer structure of CTB-VHH28注:M:高分子質量蛋白Marker;1～7:分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃加熱處理后的CTB-VHH28且加入不含β-巰基乙醇的上樣Buffer。

通過間接ELISA分析熱處理對CTB-VHH28活性的影響。如圖8(A)所示,CTB-VHH28在不高于65 ℃加熱10 min后,能保持75%以上活性,隨著溫度的升高，CTB-VHH28活性下降明顯,當加熱溫度高于85 ℃時,抗體基本失活。由圖8(B)可知,當加熱溫度不高于55 ℃,CTB-VHH28結構穩定,活性基本保持不變。綜合以上結果,可推斷CTB-VHH28失活的臨界溫度在55～75 ℃之間。

圖8 熱處理對納米抗體CTB-VHH28活性的影響Fig.8 Effect of heat treatment on activity of CTB-VHH28注:A:不同溫度處理對CTB-VHH28活性的影響; B:不同熱處理時間對CTB-VHH28活性的影響。

2.8 納米抗體CTB-VHH28的甲醇耐受性

OTA標準品難溶于水,易溶于有機溶劑,在ELISA試驗中,OTA通常用甲醇-PBS溶解,而甲醇會影響抗體的構象和抗原抗體的相互作用。如圖9所示,反應體系中甲醇濃度為2.5%時,CTB-VHH的IC50最低,可以達到0.38 ng/mL。反應體系中甲醇濃度不高于10%時,抗原與CTB-VHH28的結合能力沒有明顯變化。當反應體系中甲醇濃度為40%時,CTB-VHH28與抗原的相互作用明顯減弱,競爭抑制率下降。

圖9 CTB-VHH28甲醇耐受性分析Fig.9 Methanol tolerance analysis of CTB-VHH28

3 討論與結論

通常情況下,納米抗體從納米抗體庫中篩選得到,其表面有大量的親水殘基,保持嚴格的單體結構,即單價納米抗體。多價納米抗體是識別同一種表位的單價納米抗體的聚合物,其不僅具備單價納米抗體特性,且具有更多的抗原識別位點[22]?；魜y毒素B亞基(CTB)很容易分泌到胞外,用基因工程亦能得到高產量的CTB克隆株,即使在大腸桿菌宿主菌中,CTB仍能分泌在胞外或細胞周質[23]。本研究基于重組載體pET25b-CTB-VHH28,將其轉入到大腸桿菌BL21(DE3)中進行原核表達,實現了OTA納米抗體VHH28與CTB融合蛋白的可溶表達,并成功得到了五價的納米抗體CTB-VHH28。通過優化納米抗體CTB-VHH28表達條件,確定了最佳表達溫度為16 ℃、誘導劑濃度為0.05 mmol/L、誘導時間為10 h。經純化后得到了較純的五價納米抗體,大小為150 kDa。經測定表達量可達20 mg/L,相較于納米抗體在E.coli中常見的表達量(10 mg/L)[24],該融合蛋白表達量較好。通過對CTB-VHH28分析,本研究制備的新型納米抗體CTB-VHH具有良好的特異性,與其他幾種常見的真菌毒素無交叉反應。在反應體系中,甲醇濃度為2.5%條件下,IC50為0.38 ng/mL。通過對納米抗體CTB-VHH28熱穩定性及甲醇耐受性分析,當加熱溫度高于85 ℃時,抗體基本失活,CTB-VHH28失活的臨界溫度在55～75 ℃之間。反應體系中甲醇濃度不高于10%時,抗原與CTB-VHH28的結合能力沒有明顯變化。有利于提高檢測方法的重復性和穩定性,為建立OTA的檢測方法奠定了基礎。