1-脫氧野尻霉素對秀麗隱桿線蟲的抗衰老作用

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(1.南京師范大學生命科學學院,江蘇南京 210023; 2.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 211100)

機體氧化衰老在自然界是不可逆的,人體氧化衰老機制非常復雜。同時,由于化學藥物不良反應多、靶點專一、多耐藥性,使其防氧抗衰的科學性具有一定的爭議。天然藥物的歷史悠久,是藥物先導化合物及合成藥物的重要來源,毒副作用小、作用廣泛持久,隨著科學技術的發展,天然藥物的實驗研究越來越多,藥理藥效逐漸明確,因此對于天然藥物的研究開發已經成為目前人們關注的焦點。

1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)作為一種天然糖結構類似物,廣泛存在于桑樹及其它植物和微生物中,化學名為3,4,5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶,為高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑[1]。近年來國內外學者的研究表明,DNJ具有降血糖[2]、抗病毒[3]、抗腫瘤[4-5]以及調節血脂和影響脂肪代謝[6-8]的作用;王興婷[9]等研究發現,桑葉DNJ提取物在體外對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用;王玲[10]等通過小鼠體內灌胃實驗發現,適量DNJ可增強小鼠機體抗氧化能力,預防脂代謝異常等。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)作為一種模式生物,其結構簡單、生命周期短、與人類基因保守性較高,廣泛應用于抗衰老、藥物篩選和神經系統疾病等各方面的研究[11-12]。本實驗借助這一模式生物,進一步研究1-脫氧野尻霉素體內抗衰老作用及其機制,探究1-脫氧野尻霉素對生物體的影響,為桑科植物高值高效利用,開發抗氧化、降低血糖血脂等功能性食品提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秀麗隱桿線蟲野生型N2、突變體daf-2及突變體daf-16、大腸桿菌菌株E.coliOP50(尿嘧啶缺陷型) 均由南京野生植物綜合利用研究院提供;氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉 南京化學試劑有限公司;多聚蛋白胨、磷酸鉀、氯化鈣、七水硫酸鎂、膽固醇、酵母抽提物、二甲亞砜、次氯酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂、多聚蛋白胨 日本制藥株式會社;DNJ標準品(純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;超氧化物歧化酶測試盒、過氧化氫酶測試盒 南京建成生物工程研究所。

SPX-150B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;BG-50隔水式培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;BCD-183A冰箱 合肥榮事達電冰箱有限公司;JW-25017HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;HCB-1300V潔凈工作臺 青島海爾特種電器有限公司;奧林巴斯顯微鏡(OlympusBX41) 南京艾朗儀器有限公司;JSZ6系列連續變倍體視顯微鏡 江南永新光學有限公司;MQT-60R搖床 上海旻泉有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;移液槍 上海艾研生物科技有限公司;紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;酶標儀 賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NGM固體培養基配制 秀麗隱桿線蟲生長培養基(NGM):取975 mL蒸餾水溶解3 g氯化鈉,17 g瓊脂粉,2.5 g多聚蛋白胨,高壓蒸汽滅菌。待冷卻至55 ℃左右后,加入1 mL 1 mol/L氯化鈣,1 mL 1 mol/L硫酸鎂,1 mL 5 mg/mL膽固醇,25 mL磷酸鉀緩沖液。混勻后倒入無菌培養皿[13]。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲同步化 秀麗隱桿線蟲體內出現大量蟲卵時,在培養基上加入適量的M9緩沖液,將秀麗隱桿線蟲洗脫收集至滅菌后的1.5 mL離心管,加入1 mL秀麗隱桿線蟲裂解液(10%次氯酸∶1 mol/L氫氧化鈉=1∶1),4000 r/min,離心1 min;去除裂解液,用M9緩沖液洗滌三次(4000 r/min,離心1 min),將底層的蟲卵用移液槍吸出,涂在含有直徑1 cm的大腸桿菌OP50的培養基上,20 ℃培養48～60 h,得年輕成蟲[13]。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲暴露方法 將同步化后的秀麗隱桿線蟲轉移到含有大腸桿菌OP50的新鮮培養基中,對照組加入M9緩沖液,暴露組分別加入10、100、1000 mg/L DNJ,20 ℃處理24 h,進行后續實驗。

1.2.4 DNJ對秀麗隱桿線蟲壽命的影響 隨機挑取暴露后的秀麗隱桿線蟲至含有大腸桿菌OP50的培養基上,每組33條,每組設3個平行,20 ℃培養,同時設對照組。從轉移當天(壽命實驗第0 d)起計算線蟲存活天數,并每天記錄秀麗隱桿線蟲存活和死亡條數,實驗持續至最后一條秀麗隱桿線蟲死亡為止,以鉑金絲碰觸秀麗隱桿線蟲仍然不動即判定為死亡。根據線蟲生存、死亡的條數繪制曲線,實驗重復三次[14-15]。

1.2.5 DNJ對秀麗隱桿線蟲運動能力的影響 身體彎曲頻率測定:隨機挑取暴露后的秀麗隱桿線蟲至沒有食物的NGM培養基上觀察其身體彎曲頻率,觀察前先讓秀麗隱桿線蟲自由運動1 min,在顯微鏡下觀察并記錄1 min內秀麗隱桿線蟲的身體彎曲次數,作為身體彎曲頻率的指標,每組取20條觀察,同時設對照組。1次彎曲定義為秀麗隱桿線蟲相對于身體長軸方向上的一個波長移動,實驗重復三次。

頭部擺動頻率測定:隨機挑取暴露后的秀麗隱桿線蟲至含M9緩沖液的空白培養基上,觀察其頭部擺動頻率,觀察前先讓秀麗隱桿線蟲自由擺動恢復1 min,在顯微鏡下觀察并記錄1 min內秀麗隱桿線蟲的頭部擺動次數,作為頭部擺動頻率的指標,每組20條觀察,同時設對照組。1次頭部擺動定義為其頭部擺動方向改變,改變必須轉過其身體朝向方向,實驗重復三次[16]。

1.2.6 DNJ對秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的影響 隨機挑取20條暴露后的秀麗隱桿線蟲至涂有大腸桿菌OP50的培養基上,同時設對照組,觀察其吞咽頻率,在奧林巴斯高倍顯微鏡下，觀察并記錄1 min內秀麗隱桿線蟲的吞咽次數,作為秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的指標,實驗重復三次[16]。

1.2.7 DNJ對秀麗隱桿線蟲排泄周期的影響 隨機挑取20條暴露后的秀麗隱桿線蟲至涂有大腸桿菌OP50的培養基上,同時設對照組,將每條秀麗隱桿線蟲取出檢測,當秀麗隱桿線蟲體壁肌肉伸縮排泄到下一次體壁伸縮排泄的周期時間即為排泄周期,在奧林巴斯高倍顯微鏡下觀測其排泄周期,實驗重復三次[17]。

1.2.8 DNJ對秀麗隱桿線蟲熱激反應的影響 將暴露后的秀麗隱桿線蟲放置35 ℃條件下培養6 h,然后隨機挑取33條秀麗隱桿線蟲至含有大腸桿菌OP50的培養基上,每板33條,每組設3個平行,20 ℃培養。從轉移當天(壽命實驗第0 d)起計算秀麗隱桿線蟲存活天數,并每天記錄秀麗隱桿線蟲存活和死亡條數,實驗持續至最后一條秀麗隱桿線蟲死亡為止,以鉑金絲碰觸秀麗隱桿線蟲仍然不動即判定為死亡。根據秀麗隱桿線蟲生存的條數繪制曲線,實驗重復三次[18]。

1.2.9 DNJ對秀麗隱桿線蟲腸道活性氧(ROS)水平的影響 秀麗隱桿線蟲腸道內ROS水平分析參考文獻[19-20]方法采用熒光探針DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)檢測秀麗線蟲體內的氧自由基水平。對照組與暴露組秀麗隱桿線蟲分別被轉移到含有20 μmol/mL DCFH-DA的M9緩沖液中20 ℃孵育4 h,然后轉移到2%瓊脂糖載玻片上,利用奧林巴斯熒光顯微鏡拍照記錄。對所激發的熒光強度進行半定量分析,其熒光的強弱反映了體內ROS水平。每個濃度處理50條線蟲,實驗重復三次。

1.2.10 DNJ對秀麗隱桿線蟲抗氧化酶活力水平的影響 準確稱取對照組與處理組秀麗隱桿線蟲全部組織質量,按質量/體積1∶12 (g/mL)的比例,加入12倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下手動勻漿,2500 r/min,離心10 min,取上清液100 μL稀釋2倍待測;各組秀麗隱桿線蟲超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力的測定分別嚴格按照南京建成生物工程研究所生產試劑盒說明書要求進行[21]。

1.3 數據處理

所有數據均為平均值±標準誤差(S.E.M)。柱形圖用Microsoft Excel軟件繪制。數據分析使用SPSS 12.0軟件完成。不同組別之間使用方差分析(ANOVA)。概率水平0.05與0.01代表統計分析上的顯著性差異。壽命試驗運用2尾檢驗中的兩樣本T-檢驗。

2 結果與分析

2.1 DNJ合適濃度的篩選

2.1.1 DNJ對秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活力的影響 抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等。SOD對機體的氧化與抗氧化水平起著至關重要的作用,能清除超氧陰離子自由基,保護機體免受損傷;CAT能有效清除各種活性氧基團,從而防止這些基團對細胞膜系統的破壞。秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活力增強,則秀麗隱桿線蟲的抗氧化能力增強。如圖1所示,與對照組相比,10、100、1000 mg/L DNJ處理的秀麗隱桿線蟲的SOD、CAT活力均極顯著增強(p<0.01),由此說明DNJ能夠增強秀麗隱桿線蟲的抗氧化作用。其中,SOD活力與DNJ呈劑量相關性,而100 mg/L DNJ處理的秀麗隱桿線蟲CAT活力明顯高于1000 mg/L DNJ處理的秀麗隱桿線蟲CAT活力,可能由于藥物濃度過高,導致秀麗隱桿線蟲出現機體損傷,抗氧化能力減弱。

圖1 不同濃度DNJ對秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活性的影響Fig.1 The activity of antioxidant enzyme of the C.elegans treated with different concentrations of DNJ注:與對照組相比,*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。圖3～圖6、圖9～圖12同。

2.1.2 DNJ對體內腸道ROS水平的影響 腸道ROS富集對有機體極其有害,當ROS水平超出防御機制所及范圍,細胞就處于氧化脅迫狀態,引發脂質過氧化、蛋白質氧化、核酸損傷和酶失活,并能激活程序性細胞死亡[22-23]。熒光探針DCFH-DA與ROS結合,若結合程度越高,熒光強度就越亮,則腸道內ROS含量越高,反之,若結合程度越低,熒光強度就越暗,則腸道內ROS含量越低。如圖2所示,與對照組相比,10、100、1000 mg/L DNJ處理的秀麗隱桿線蟲隨濃度增大熒光強度越來越暗,說明秀麗隱桿線蟲隨DNJ濃度增大,脂質過氧化程度越來越弱。因此,10、100、1000 mg/L DNJ均能夠降低秀麗隱桿線蟲腸道內ROS水平,提高秀麗隱桿線蟲的抗氧化能力。

圖2 不同濃度DNJ對秀麗隱桿線蟲腸道活性氧水平的影響Fig.2 The intestinal active oxygen level of the C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.3 DNJ對秀麗隱桿線蟲壽命的影響 壽命是秀麗隱桿線蟲經樣品處理前后變化最直接的反映,如圖3所示,與對照組相比,10、100 mg/L DNJ能夠顯著延長秀麗隱桿線蟲的壽命和半數死亡時間(p<0.05),但1000 mg/LDNJ則顯著縮短了秀麗隱桿線蟲的壽命和半數死亡時間(p<0.05),這可能由于,藥物濃度過高對秀麗隱桿線蟲機體損傷所致。在抗氧化酶活力測定時發現,1000 mg/L DNJ處理秀麗隱桿線蟲的CAT活力較100 mg/LDNJ處理的CAT活力也有所下降,因此綜上三項評價指標,后續實驗DNJ濃度確定為:10、100 mg/L。

圖3 不同濃度DNJ對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.3 Lifespan of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.4 DNJ對秀麗隱桿線蟲運動能力的影響 運動行為常常被作為反映神經系統基本功能的指標,可以用來評價秀麗隱桿線蟲在樣品處理前后神經系統功能是否發生改變。常采用頭部擺動和身體彎曲兩個表型指標來評價運動行為能力。如圖4所示,與對照組相比,10、100 mg/L的DNJ處理組秀麗隱桿線蟲,身體彎曲和頭部擺動均極顯著增強(p<0.01),因此10、100 mg/L的DNJ均能極顯著提高秀麗隱桿線蟲的運動行為能力,降低秀麗隱桿線蟲的機體氧化,保護神經系統功能。

圖4 不同濃度DNJ對秀麗隱桿線蟲運動行為的影響Fig.4 Behavior of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.5 DNJ對秀麗隱桿線蟲排泄周期的影響 排泄周期是評價秀麗隱桿線蟲抗氧化的重要指標,秀麗隱桿線蟲生長狀態越好,其代謝能力越強,排泄周期越短。如圖5所示,與對照組相比,10、100 mg/L的DNJ處理組的秀麗隱桿線蟲,排泄周期極顯著縮短(p<0.01),代謝能力隨DNJ濃度增加而增強,因此10、100 mg/L的DNJ能夠維持秀麗隱桿線蟲代謝能力,提高機體抗氧化水平。

圖5 DNJ對秀麗隱桿線蟲排泄周期的影響Fig.5 Defecation cycle of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.6 DNJ對秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的影響 吞咽頻率能夠反映秀麗隱桿線蟲攝食能力,并且秀麗隱桿線蟲壽命可以通過咽泵運動速率來間接進行評價[24]。如圖6所示,與對照組相比,10、100 mg/L的DNJ處理組秀麗隱桿線蟲吞咽頻率極顯著增加(p<0.01),與DNJ對秀麗隱桿線蟲壽命影響相統一,因此進一步說明10、100 mg/L的DNJ在秀麗隱桿線蟲體內發揮一定的抗氧化作用。

圖6 不同濃度DNJ對秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的影響Fig.6 Pumping frequency of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.7 DNJ對秀麗隱桿線蟲的抗急性熱應激效應的影響 綜上指標表明,100 mg/L的DNJ對秀麗隱桿線蟲的抗氧化作用比較顯著,因此熱應激僅選用100 mg/L的DNJ對線蟲進行處理。文獻報道,熱應激效應能引起細胞的氧化應激,導致機體組織細胞內氧化代謝產物增加,氧自由基、過氧化物含量增高,抗氧化酶分解氧化物速度很難跟上氧化代謝反應的速度,嚴重影響了機體正常的生理代謝,發生組織損傷[25],因此100 mg/L的DNJ處理秀麗隱桿線蟲,若生長狀態越好,則抗氧化能力越強,其抗熱應激能力就會越強。如圖7所示,與對照組相比,100 mg/L的DNJ組秀麗隱桿線蟲生存曲線右移,說明抵抗熱應激效應的能力均有所增強,其抗氧化能力明顯增強。

圖7 100 mg/LDNJ對秀麗隱桿線蟲的抗急性熱應激效應的影響Fig.7 Heated stress conditions of C.elegans treated with 100 mg/L of DNJ

2.2 基因daf-2和daf-16在DNJ處理秀麗隱桿線蟲過程中作用研究

在秀麗隱桿線蟲中,daf-2作為胰島素受體同源物定位于細胞膜上,為線蟲中表達胰島素受體家族的唯一成員。它與胞外類似胰島素配體結合后,在細胞內產生一系列的信號級聯反應,最終通過磷酸化daf-16,而抑制其進入細胞核發揮轉錄調節功能,延長動物的壽命[26-27]。選用100 mg/L DNJ借助線蟲單突變體探究基因daf-2和daf-16在DNJ處理線蟲過程中是否發揮作用。

實驗結果表明,突變體daf-2和daf-16與自身對照相比,在100 mg/L DNJ處理下,均能延長突變體daf-2和daf-16的壽命(見圖8),同時能顯著提高其身體彎曲頻率(p<0.05，見圖10),極顯著提高頭部擺動頻率(見圖10)、縮短排泄周期(見圖9)、提高吞咽頻率(p<0.01,見圖11)。突變體daf-2和daf-16在35 ℃熱激6 h條件下,100 mg/L DNJ處理能顯著提高秀麗隱桿線蟲熱應激能力,延長壽命(見圖12);同時,野生型N2與自身對照相比,在100 mg/L DNJ處理下,也能延長壽命,同時能極顯著提高其身體彎曲頻率、頭部擺動頻率、縮短排泄周期(p<0.01，見圖1～7);因此突變體與野生型在100 mg/L DNJ處理下,分別與自身對照相比,各表型差異沒有顯著性(p>0.05,見圖8～圖13)。因此,一定濃度的1-脫氧野尻霉素在秀麗隱桿線蟲體內起到了抗衰老作用,但其作用機制與daf-2和daf-16基因無關。

圖9 100 mg/LDNJ對突變體daf-2和daf-16排泄周期的影響Fig.9 Defecation cycle of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/L of DNJ

圖10 100 mg/L DNJ對突變體daf-2和daf-16的運動能力的影響Fig.10 Behavior of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/L DNJ

圖11 100 mg/L DNJ對daf-2和daf-16吞咽頻率的影響Fig.11 Pumping frequency of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/LDNJ

圖12 熱激條件下100 mg/L DNJ處理對daf-2和daf-16的壽命的影響Fig.12 Lifespan of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/LDNJ by heating stress

圖13 熱激條件下100 mg/L DNJ處理的突變體daf-2和daf-16與N2的壽命差異Fig.13 Lifespan differences between mutants of daf-2, daf-16 and N2 treated with DNJ by heating stress

3 結論

本文中秀麗隱桿線蟲的壽命、抗氧化酶活力、腸道氧自由基水平等指標,表明DNJ能夠提高秀麗隱桿線蟲的抗氧化能力,與報道的桑葉DNJ提取物在體外具有良好的抗氧化能力及適量 DNJ可增強小鼠機體抗氧化能力的實驗結果基本一致[11-12]。研究報道,daf-2是線蟲中表達的胰島素受體家族的唯一成員,激活daf-16或抑制daf-2是調節胰島素信號通路延緩秀麗隱桿線蟲衰老的關鍵[28],因此本文通過實驗篩選出100 mg/L DNJ濃度后,借助線蟲daf-2和daf-16單突變體實驗發現daf-2和daf-16基因在DNJ處理線蟲過程中并不發揮作用,為進一步證實DNJ對秀麗線蟲可能的作用機制,還需進一步對其基因進行后續研究。綜上分析,100 mg/L DNJ對秀麗隱桿線蟲的抗衰老作用最佳,但其作用機制與daf-2和daf-16基因無關;同時DNJ含量是影響桑葉保健品質的主要指標之一,本實驗為桑葉及其他天然植物保健品合適用量的開發利用提供進一步的理論依據。