酶法與非酶法磷酸化改性食品蛋白質的研究進展

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(1.武漢市農業科學院水產研究所,湖北武漢 430207; 2.武漢市農業科學院農產品加工研究中心,湖北武漢 430207; 3.華中農業大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

利用生物、化學手段從分子水平上改變蛋白分子的氨基酸側鏈基團結構,或特異性的剪切蛋白分子主鏈,從而改善食品蛋白質的理化及功能性質,擴展蛋白質在食品體系中的應用,是近年來食品科學領域的研究熱點之一。蛋白質的磷酸化反應是調節蛋白結構和功能、參與和調控生化反應的重要修飾過程。在食品工業中,利用生物或化學手段磷酸化,從而達到改善蛋白質的功能性質、提高蛋白質的溶解性以及加工過程中抗變性的能力,獲得專項功能性性較好或具有多種優良特性的蛋白衍生物,已受到廣泛的研究關注。根據磷酸化途徑的不同,蛋白質的磷酸化反應主要可以分為酶法磷酸化和非酶化學法磷酸化。酶法磷酸化是指通過蛋白激酶的催化,將ATP或GTP上的磷酸基團轉移到底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等殘基側鏈上的過程[1]。具有反應條件溫和、磷酸化位點專一等特點。相對于酶法磷酸化,非酶法磷酸化因其成本低廉、效果顯著且具有多種可選的化學磷酸化試劑而有著更廣泛的研究應用。不同的磷酸化試劑具有不同的反應途徑及作用位點,并在蛋白分子中引入不同性質的磷酸鍵,從而引起食品蛋白質結構與功能性質不同程度的改變。

本文通過對酶法及非酶法磷酸化的反應機制、反應特點的對比介紹,分別從磷酸化對蛋白結構與功能特性影響的角度,詳細闡述了不同蛋白激酶及磷酸化反應試劑對食品蛋白質的改性效果。并通過對不同食品蛋白質的修飾水平及磷酸化位點的介紹,分析了蛋白激酶和磷酸化試劑與食品蛋白質的相互作用機制。旨在為針對性的選擇磷酸化反應方式與試劑改善蛋白功能特性、擴展磷酸化改性在食品蛋白質中的應用提供理論參考。

1 蛋白質的酶法磷酸化改性

從食品的安全性上考慮,酶法磷酸化改性是食品蛋白磷酸化改性的重要途徑。酶法磷酸化反應條件溫和,反應位點專一,易于定向控制并產生均一的產物,且蛋白營養價值損失少。酶法磷酸化一般采用蛋白激酶來催化,并通過對蛋白質一級結構的識別進行特定位點的磷酸化。

1.1 蛋白激酶的磷酸化反應機制

大多蛋白激酶進行磷轉移的催化活性狀態所呈現的關鍵結構特征非常相似[2-3]。蛋白激酶發生磷酸化的活性片段是一個主要的調控元件,可以作為蛋白激酶催化活性的開關。該活性開關屬于絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)激酶家族的不同類型。蛋白激酶通過氨基酸殘基與活性位點接觸并形成網絡,從而調節磷酸化作用,保持激酶的最高活性狀態。穩定催化位點的關鍵殘基是不變的,且不同亞群的激酶具有相似的調節機制[4]。

圖1為蛋白激酶晶體的典型的雙葉形結構,為Ser/Thr或Tyr激酶的催化作用核心。激酶的N末端反平行β-折疊結構由五條β鏈和單個α-螺旋(稱為αC-螺旋)構成,C末端主要由α-螺旋組成[5]。蛋白激酶的C-末端有長度為20～30個氨基酸殘基,既是酶與底物結合位點一部分,也是激活磷轉移的序列。蛋白激酶的C-末端還含有催化環,其中天冬氨酸(D166)可以作為催化基礎,促進質子從底物磷酸化位點的羥基側鏈脫去。核苷酸(ATP)和底物的結合位點位于C末端和N末端之間的凹處,ATP是通過其本身的磷酸基團與蛋白激酶的C-端和N-端的保守殘基相互作用來轉移磷元素的[6-7]。在各種激酶的催化作用下,通過ATP對具有可磷酸化位點的蛋白質進行定向選擇的磷酸化改性,反應機制如圖2所示。

圖1 Ser/Thr或Tyr激酶的催化作用核心結構及關鍵功能區域[2]Fig.1 The 3D fold of catalytic core of Ser/Thr or Tyr kinase with their key functional elements[2]

圖2 酶法磷酸化絲氨酸示意圖(Science Slides)Fig.2 Serine phosphorylation of proteins by phosphokinase(Science Slides)

1.2 CAMP依賴蛋白激酶(CAMPdPK)的磷酸化反應

CAMP依賴蛋白激酶(CAMP-dependent protein kinase,CAMPdPK)是一種依賴于環磷酸腺苷激活的蛋白質激酶,能特異性的磷酸化氨基末端的絲氨酸殘基(Ser)。氨基末端側鏈含Ser的序列必須同時含有堿性氨基酸殘基,例如精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)殘基。CAMPdPK作用的磷酸化位點的序列類型為-Lys-Arg-X-X-Ser-和-Arg-Arg-X-Ser-,其中X可以是任何氨基酸殘基[8]。

通過CAMPdPK對大豆蛋白進行酶法改性,大豆蛋白11S酸性亞型的磷酸化程度可以達到2 mol Pi/mol蛋白質,且磷酸化僅發生于絲氨酸殘基。磷酸化后大豆蛋白11S亞型的結構僅發生了輕微的改變,無規則結構增加、芳香氨基酸殘基更加暴露于溶液中,然而大豆蛋白11S亞型的分子量沒有發生改變,表明酶法磷酸化未引起蛋白分子的交聯[9]。Ross[10]研究了CAMPdPK磷酸化大豆貯藏蛋白的最適條件,發現短暫的熱處理可以促使大豆蛋白亞基解離、結構伸展,從而增加大豆蛋白的溶解度,提高磷酸化程度。當ATP與二硫蘇糖醇的添加量分別為40 pmol/L和1.28 mmol/L、底物的大豆貯藏蛋白濃度為0.1%,磷酸化反應3 h時磷酸化程度最大,且磷酸化程度隨著實驗范圍內CAMPdPK 濃度的增加不斷增加。Campbell等[11]發現CAMPdPK磷酸化大豆分離蛋白的溶解性和乳化活性提高,乳液穩定性和起泡性也隨磷酸化顯著改善,但泡沫穩定性較差;進一步采用閃爍計數和放射自顯影技術表征磷酸化過程,發現32Pi最初與大豆球蛋白的酸性多肽發生反應,隨后作用于堿性多肽,極少數的32Pi與β-伴大豆球蛋白的β和α/α′亞型發生反應。Aluko等[12]研究了CAMPd PK磷酸化的豇豆球蛋白在pH3～8范圍內的功能特性,由于親水性的磷酸基團增加了蛋白與水相的相互作用,磷酸化后豇豆球蛋白在pH4～6范圍內溶解度顯著增加,并在pH4和5時顯示出更好的起泡性和泡沫穩定性。這可能由于帶負電荷的磷酸基團增加了蛋白分子間的靜電斥力,導致蛋白結構伸展,從而在空氣/水界面更好的發生定位和重排。且靜電相互作用在接近蛋白pI時最大化,此時磷酸基團對靜電力影響最顯著。然而,增加的靜電斥力同時也導致磷酸化豇豆球蛋白在油/水界面的蛋白吸附率下降,界面膜強度減小,造成豇豆球蛋白的乳化活性下降。但當乳液體系形成后,蛋白乳液間靜電斥力的增加又有利于提高乳液體系的穩定性。

最新的研究還發現磷酸化在調控蛋白自組裝纖維化進程中的作用。通過CAMPdPK磷酸化含有α螺旋、β折疊結構和CAMPdPK識別序列的模型肽,發現磷酸化在肽鏈從無規則卷曲-富含β折疊結構的寡聚體-原纖維-淀粉樣纖維的構象轉變過程中,誘導肽鏈的β-折疊結構伸展,從而抑制不溶性淀粉樣纖維的形成,促進低聚體和原纖維的形成。顯示了酶法磷酸化和去磷酸化在觸發或抑制纖維蛋白形成上的調控作用[13]。

1.3 酪蛋白激酶Ⅱ(CK-Ⅱ)的磷酸化反應

酪蛋白激酶Ⅱ(CAMP-independent type Ⅱ casein kinase)是一種從酵母(YarroeisLipolytia)中提取和純化的不依賴鈣和CAMP調節的多功能蛋白質激酶,它能專一識別底物Ser/Thr-X-X-Asp/Glu序列中可磷酸化的Ser和Thr,還能與Tyr發生磷酸化反應[14]。

采用CK-Ⅱ對酪蛋白及大豆球蛋白(7S)磷酸化改性,二者的溶解度在磷酸化后均提高,且磷酸化的酪蛋白和大豆球蛋白(7S)的氨基酸的指紋圖譜表明CK-Ⅱ作用的靶氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸[15]。對大豆中兩種貯藏蛋白通過CK-Ⅱ磷酸化,發現磷酸化特異性的發生在大豆球蛋白7S亞型的α和α′亞基及11S亞型的酸性亞基[16]。為了進一步的確定CK-Ⅱ的磷酸化位點,Fouques等[17]用胰蛋白酶消化磷酸化β-伴大豆球蛋白的α亞基,對所得肽進行RP-HPLC偶聯LC-ESMS的分析,鑒定到兩個磷酸化的肽段分別對應氨基酸殘基70～89和116～127,其中Ser75和Ser117發生磷酸化。

然而對于某些天然狀態下的蛋白如溶菌酶、牛血清蛋白和肌酸激酶而言,通常不能直接進行酶法磷酸化。為了滿足作為底物蛋白的序列要求、更易與蛋白激酶發生反應,還需要通過熱處理使埋藏在蛋白分子內部的絲氨酸或蘇氨酸殘基暴露[18],從而限制了酶法磷酸化的進一步研究與應用。

2 蛋白質的非酶法磷酸化改性

非酶的化學法磷酸化由于其使用試劑廉價、反應簡單和效果顯著等特點,在食品工業上有較大的應用價值。化學磷酸化的實質為磷酸化試劑提供無機磷,蛋白質分子中的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的羥基提供氧原子,或者是精氨酸、賴氨酸、組氨酸的氨基提供氮原子(Lys的ε-氨基、His咪唑環1,3位N和Arg的胍基末端N),兩者形成-C-O-Pi或-C-N-Pi 的酯化反應[19]。但是,不同的磷酸化試劑與蛋白質發生反應的部位和途徑都有所不同,常見的磷酸化試劑有:三氯氧磷、焦磷酸鈉和三聚磷酸鈉等。

2.1 三氯氧磷(POCl3)參與的磷酸化

三氯氧磷(POCl3)是一種高反應活性的試劑,被廣泛用于蛋白質磷酸化改性中。POCl3在溶液或固相體系中都可使蛋白質磷酸化,其與蛋白質共價結合的磷含量量最高可以達到3.9%。

2.1.1 POCl3磷酸化的反應機制及磷酸鍵性質 POCl3可以形成兩個高活性的中間體(反應式(1)和(2))進而與蛋白質的功能基團絲氨酸和蘇氨酸(反應式(3))形成磷酸酯鍵,或與賴氨酸和組氨酸(反應式(4))發生反應生成磷酸酰胺[20]。此外,天冬氨酸和谷氨酸殘基也能夠與POCl3形成磷酸酸酐。且POCl3與蛋白反應的主要形式為二磷酸酯鍵和三磷酸酯鍵[21]。

通過磷酸化蛋白對pH的穩定性、磷酸化蛋白賴氨酸基團活性的變化,以及結合31P核磁共振(NMR)光譜等分析手段研究不同蛋白磷酸鍵的性質。結果表明,POCl3的磷酸化位點主要發生在賴氨酸殘基上,少數發生在蘇氨酸或絲氨酸的羥基基團上,如表1所示。蛋白磷酸鍵的性質主要受到反應pH的影響,如磷酸化酪蛋白的磷酸鍵在pH2.0～8.5的范圍內穩定;且Schwenke[22]研究發現大豆蛋白12S亞型的磷酸基團在pH8.0時最穩定,此時蛋白的氨基和羥基基團都參與磷酸化;而當反應pH提高到10～11時,磷酸化反應主要發生在羥基上。

表1 POCl3磷酸化的蛋白磷含量及磷酸鍵性質Table 1 The phosphorus content and phosphate linkage of protein phosphorylated by POCl3

式(1)

Intermediate 1

式(2)

Intermediate 2

式(3)

式(4)

2.1.2 POCl3磷酸化對蛋白質功能性質的影響 已有研究表明,POCl3磷酸化不會影響蛋白的體外消化性(胰蛋白酶,胃蛋白酶和氨基肽酶體系)。Huang等[23]采用POCl3對酵母蛋白磷酸化改性,結果顯示,磷酸化提高了酵母蛋白的溶解性、持水性、乳化活性和起泡性,磷酸化后酵母蛋白溶液的黏度增加。Hirotsuka等[24]的研究也表明POCl3磷酸化可以有效改善大豆蛋白的溶解性、持水性、乳化活性和起泡性以及玉米醇溶蛋白的溶解性和乳化活性。

Matheis[25]通過POCl3磷酸化酪蛋白和玉米醇溶蛋白,并使用與哺乳動物相似的必需氨基酸需求和類似酶系統的嗜熱四膜蟲體系來評價磷酸化酪蛋白和玉米醇溶蛋白的營養特性。發現磷酸化不影響酪蛋白體系中嗜熱四膜蟲的生長,且未磷酸化修飾的玉米醇溶蛋白體系中嗜熱四膜蟲的相對生長效應僅為4.5%,而磷酸化玉米醇溶蛋白體系中的嗜熱四膜蟲的相對生長效應為49%。

此外,通過POCl3磷酸化,大豆蛋白、酪蛋白、血清球蛋白、血清蛋白和谷蛋白的凝膠形成能力提高;磷酸化也可以改善β-乳清蛋白、酪蛋白(α-、β-和κ-)的結合鈣離子的能力。進一步研究表明,β-乳球蛋白通過POCl3磷酸化后,在Ca2+存在下不經加熱便可形成凝膠,這是Ca2+與帶負電荷的磷酸基團之間交聯的結果[26-29]。吳磊燕[30]系統研究了POCl3磷酸化玉米醇溶蛋白(Zein)的界面行為,發現磷酸化提高了Zein的界面活性,在空氣-水界面形成的蛋白膜黏性模量(Eυ)增加;磷酸化通過改變 zein 蛋白膜的表面和機械性能,降低zein 蛋白膜表面疏水性,增加蛋白膜的臨界表面張力。此外,磷酸化還使得zein形成的蛋白膜結構緊密,膜的機械性能如延伸率顯著提高,蛋白膜的柔韌性提高[31-32]。

2.1.3 POCl3磷酸化對蛋白質構象的影響 POCl3對蛋白構象的影響主要表現為使蛋白的二級結構發生變化,α-螺旋降低、無規卷曲增加從而導致結構松散;已有研究表明人血清蛋白的熒光光譜在磷酸化后發生顯著的紅移現象,表明磷酸化導致蛋白質的三級結構伸展,且磷酰基的接入同時導致蛋白酪氨酸殘基的熒光猝滅;,由于蛋白三級結構的構象變化導致疏水基團的暴露,磷酸化后玉米醇溶蛋白的表面疏水性增加[22,33]。

POCl3對蛋白構象的影響還表現為引起蛋白質分子間的交聯,SDS-PAGE結果表明磷酸化程度越大生成的聚合物分子量越大,這些交聯鍵的形式可能包括O,O′-磷酸二酯和N,N′-磷酸二酰胺鍵以及異肽鍵。此外,蛋白質的游離氨基或羥基也可以與磷酸化蛋白質的磷酰基反應[20,22]。然而,這些交聯產物的性質是未知的,可能會生成具有潛在毒性的殘基。

此外,POCl3易在水溶液中發生劇烈的放熱反應并迅速降低體系的pH,造成蛋白質的變性,因此,需先將POCl3溶解于有機溶劑后逐滴加入到蛋白質溶液中,整個反應過程需要在冰水浴中進行,并且殘余POCl3難以與蛋白分離。

2.2 焦磷酸鈉參與的磷酸化

2.2.1 焦磷酸鈉磷酸化的反應機制及磷酸鍵性質 在焦磷酸鈉的存在下干燥加熱蛋白質,蛋白質的功能特性得到一定的改善。干燥狀態下的磷酸化過程可以通過以下反應方程式來表示:

X—OH+H3PO4=X—O—H2PO3+H2O

式(5)

表2 干燥加熱條件下食品蛋白質與焦磷酸鈉反應的磷酸化程度Table 2 Introduced phosphorus content of various food proteins by dry-heating in the presence of pyrophosphate

Li等[36]通過31P NMR光譜鑒定到焦磷酸鈉磷酸化的蛋清蛋白中,磷酸基團的存在形式為磷酸單酯、磷酸二酯和多磷酸酯鍵。在磷酸化卵白蛋白中磷酸基團與蛋白分子中的糖鏈發生接枝反應,形成磷酸二酯和多磷酸酯鍵。磷酸化大豆白蛋白則是在絲氨酸和糖鏈上同時引入磷酸基團。磷酸化溶菌酶的31P NMR光譜中出現三重峰,表明溶菌酶的磷酸基團的兩端還存在單磷酸。而在磷酸化聚賴氨酸中,磷酸基團與聚賴氨酸反應生成含N-P鍵的磷酸肌酸或磷酸精氨酸。這些結果表明,通過焦磷酸鹽磷酸化改性不同種類的蛋白質,磷酸鍵的類型具有很大的差異。

2.2.2 焦磷酸鈉磷酸化對蛋白質構效關系的影響 SDS-PAGE結果表明,由于引入帶負電荷的磷酸基團,隨著磷酸化程度的增加,蛋清蛋白和卵轉鐵蛋白(OTF)的電泳移動性增加,且磷酸化不會引起蛋清蛋白的熱聚合效應。磷酸化后,蛋白分子的離子間相互作用增強,熱穩定性提高;磷酸化提高了卵白蛋白和大豆清蛋白的水/油結合能力,并進一步提高蛋白乳化性。與油/水界面相似的,磷酸化還可以改善蛋清蛋白和大豆清蛋白在空氣/水界面的起泡性和泡沫穩定性,通過顯微鏡觀察發現磷酸化蛋清蛋白形成的泡沫細膩均勻、密度小且膨脹率高[35,37]。此外,磷酸化可以促進蛋白形成更堅固和透明的熱誘導凝膠,并進一步提高熱凝膠的持水能力[38-39]。在改善蛋白質功能特性的同時,磷酸化修飾的食品蛋白質還表現出了更好的生理活性。磷酸基團與鈣離子的相互作用使得磷酸化后的蛋清蛋白、卵白蛋白、牛血清蛋白和卵轉鐵蛋白促進磷酸鈣的溶解能力增加,并進一步促進鈣的吸收。從而表現出磷酸化蛋白作為促進鈣吸收的功能性食品的潛在應用前景。研究也表明,磷酸化的蛋清蛋白在α-胰蛋白酶和肌動蛋白酶E水解體系中的體外消化率增加[40-43]。Yin等發現由于磷酸化蛋清蛋白疏水基團的暴露,增加了與沒食子酸酯(EGCG)的結合,磷酸化蛋清蛋白與EGCG結合前后的抗氧化活性,包括ABTS+自由基清除能力、氧自由基的抗氧化能力,還原力,螯合能力和超氧陰離子清除活性均顯著的改善[44]。

通過焦磷酸鈉的磷酸化修飾,卵白蛋白、蛋清蛋白和大豆清蛋白的表面疏水性增加;圓二色譜表明磷酸化對蛋白質的二級結構影響較小,其中大豆清蛋白的無規卷曲結構發生輕微的變化,卵白蛋白的α-螺旋含量略微減少;由于磷酸基團的屏蔽效應,磷酸化后卵白蛋白和大豆清蛋白的色氨酸內源熒光的熒光強度降低;DSC結果表明磷酸化的卵白蛋白呈現熔融(部分伸展)的構象。此外,磷酸化后卵白蛋白分子的巰基與二硫鍵之間的交換反應增強[36-38,40]。

2.2.3 焦磷酸鈉的磷酸化位點鑒定 對焦磷酸鈉磷酸化的卵白蛋白、溶菌酶的磷酸化位點進行研究,通過MALDI-TOF/MS檢測溶菌酶的磷酸化位點為:Tyr20、Ser36、Thr40、Thr43、Thr47、Ser50、Thr51、Thr53、Ser60、Thr69、Ser72、Ser81、Ser85、Ser86、Thr89、Ser91、Ser100和Thr118,即焦磷酸鈉可以與溶菌酶的Tyr,Thr和Ser殘基反應,形成O-P,O-PP和O-PPP形式的磷酸酯鍵,其中在Thr118位點的磷酸酯鍵為O-PPP形式。對磷酸化卵白蛋白通過 MALDI-TOF/MS檢測到的磷酸化位點為:Ser68、Thr91、Lys92、Tyr97、Ser98、Ser100、Ser103、Tyr111、Tyr117、Tyr125、Thr136、Ser147、Ser151、Thr153、Thr201、Ser205、Tyr212、Ser221、Ser224和Ser344,即焦磷酸鈉可以與卵白蛋白的Tyr,Thr,Ser和Lys殘基發生反應。其中Ser68和Ser344為卵白蛋白的天然磷酸化位點。磷酸化卵白蛋白的磷酸酯鍵的形式為O-P和O-PP[39]。Wang等[45]通過LC-FTICR/MS檢測磷酸化卵白蛋白的位點,焦磷酸鈉與卵白蛋白反應時間為1、2和5 d,對應的磷酸化位點數分別為8,8和10。LC-FTICR/MS鑒定到的磷酸化位點為:Tyr42、Ser48、Thr49、Thr51、Ser68、Ser100、Ser103、Ser147、Ser151、Thr153、Ser221、Ser224、Phe234、Ser236、Thr238、Ser240、Ser344,Thr373和Ser384,即卵白蛋白的Tyr,Thr,Ser和Phe殘基參與磷酸化反應,而Lys未參與磷酸化。其中,磷酸化肽段41-59,142-157在反應時間從1 d增加至2 d時從單磷酸化轉變為多磷酸化。

2.3 三聚磷酸鈉參與的磷酸化

2.3.1 三聚磷酸鈉(STPP)磷酸化的反應機制及磷酸鍵性質 三聚磷酸鈉(STPP)是FDA允許的安全性食品添加劑。由于蛋白分子自由氨基(羥基)上氫原子的電子云偏向氮(氧)原子,因此自由氨基(羥基)具有親核性。在STPP結構中(①P-O-②P-O-③P)兩端磷氧鍵①P-O和O-③P的鍵能最低,穩定性較差,因而STPP中呈正電性的磷原子易與蛋白分子中親核性的羥基或氨基發生反應[46]。而不同pH條件下,蛋白質的氨基或羥基反應活性不同。蛋白質分子中的自由氨基的活性較大,而自由羥基在pH>9的堿性環境中才能顯示出較高的活性;因此在反應p H為7～9范圍內,STPP主要與蛋白分子的自由氨基反應。STPP與蛋白質在p H7～9時的反應可以表示如下:

式(6)

已有研究表明,STPP可以與大豆分離蛋白的絲氨酸殘基發生酯化反應,賴氨酸殘基發生酰化反應。通過紅外光譜和蛋白分子中磷酸基團的穩定性分析表明,大豆分離蛋白的絲氨酸、蘇氨酸殘基的-OH 和賴氨酸殘基的ε-NH2均與磷酸基團發生了反應[47]。Xiong等[48]通過紅外光譜、X-射線光電子能譜及31P NMR 分析STPP磷酸化的卵白蛋白的磷酸鍵特性,發現磷酸基團與卵白蛋白的絲氨酸、蘇氨酸殘基的-OH以及賴氨酸和精氨酸的-NH2反應,形成C-O-P和C-N-P鍵。而由于C-N-P鍵對pH不穩定,在磷酸化的卵白蛋白中磷酸鍵的主要存在形式為O-P。

2.3.2 STPP磷酸化對蛋白質構效關系的影響 通過STPP磷酸化后,大豆分離蛋白的水溶性、持水能力、乳化活性和蛋白溶液表觀粘度均顯著提高,磷酸化大豆分離蛋白和酪蛋白的起泡能力和泡沫穩定性增加[49-50]。Xiong等[51]研究了磷酸化對卵白蛋白在油/水界面的界面行為影響機制,由于磷酸化后卵白蛋白電負性增加,引起Zeta電位增加,使卵白蛋白分子間靜電斥力增加,從而抑制乳液液滴的聚集,導致乳化液滴的平均粒徑減小,使蛋白分子可以更迅速的擴散到油/水界面、降低界面張力,提高卵白蛋白的乳化活性。圓二色譜表明,磷酸化后卵白蛋白分子的β-折疊結構含量增加,促進了油/水界面處相鄰蛋白質分子的相互作用,有助于形成更致密和剛性的界面膜。同時,磷酸化使得卵白蛋白分子的酰基無序化程度增加,酪氨酸和色氨酸殘基暴露于更加極性的環境中。藺丹華[52]采用胰蛋白酶水解磷酸化酪蛋白,發現水解程度隨著磷酸化程度的增加而增加,SDS-PAGE和SEC-HPLC結果表明磷酸化后的酶解產物生成分子量更小的肽段,即磷酸化促進了酪蛋白的酶解效率。

許多研究表明STPP的磷酸化修飾在改善食品蛋白質凝膠特性方面取得了良好的效果。磷酸化的乳清蛋白可以在酸性環境中誘導凝膠的形成,使酸奶的硬度和粘度提高,并呈現均勻、致密的凝膠網絡結構,從而改善酸奶質地,作為天然的酸奶增稠劑[53]。采用STPP修飾的明膠zeta電位下降、負電荷增加,從而導致強的離子間相互作用。當STPP的添加量為0.08%時,明膠的凝膠強度最大,且凝膠的微觀結構更致密[54]。此外,蛋白質的磷酸化改性可以促進鈣離子的交聯,使蛋白質分子間通過離子鍵形成鈣橋結構,從而增強凝膠網絡結構[55]。采用CaCl2對磷酸化刺參膠原蛋白凝膠進行交聯,磷酸化刺參膠原蛋白凝膠的硬度及粘性提高,凝膠與水分子的結合能力提高,使得膠原纖維結構更加穩定[56]。在磷酸化明膠中添加CaCl2和ZnCl2,凝膠強度隨著CaCl2和ZnCl2濃度的增加而增加,且添加CaCl2的磷酸化明膠比添加ZnCl2具有更高的凝膠強度[57]。

2.3.3 STPP的磷酸化位點鑒定 Xiong等[51]使用STPP分別在反應pH5,7和9(P-OVA5,P-OVA7 和 P-OVA9)的條件下與卵白蛋白反應12 h,通過MALDI-TOF MS鑒定到的磷酸化肽段及位點如表3。通過對MS/MS結果分析,發現磷酸化主要發生在絲氨酸殘基的羥基,較少發生在蘇氨酸殘基。由于磷酸基團之間存在靜電斥力,卵白蛋白的天然磷酸化肽段通常被認為難以進一步的磷酸化,然而該研究發現STPP磷酸化修飾的卵白蛋白中,天然的磷酸化肽段成功接入了新的磷酸基團,并首次鑒定到磷酸化位點Ser353和Ser355。進一步的采用13C NMR精確定位磷酸化位點,發現磷酸化主要發生在卵白蛋白分子中絲氨酸殘基的βCH2基團的C 原子位置[58]。

表3 MALDI-TOF MS鑒定磷酸化OVA(P-OVA5,P-OVA7和P-OVA9)典型肽段得到的磷酸根基團數量和位點[51]Table 3 The possible number of phosphate groups and sites in tryptic peptides from phosphorylated OVA (P-OVA5,P-OVA7 and P-OVA9)identified by MALDI-TOF MS[51]

2.4 其他

利用美拉德反應的磷酸化也是一種有效的非酶法磷酸化方法。一般通過美拉德反應的磷酸化可以分為兩種途徑,一種是先糖基化修飾蛋白,使其反應活性基團增加,再進一步對蛋白進行磷酸化;另一種是直接通過葡萄糖-6-磷酸(G6P)與蛋白發生美拉德反應而引入磷酸根基團。

2.4.1 糖基化蛋白的磷酸化 Li等[59]認為,乳清分離蛋白具有較低的糖含量,直接對其進行磷酸化修飾的效率較低,而引進足夠的糖鏈可以有效的提高乳清分離蛋白的磷酸化效率。對糖基化乳清分離蛋白進一步磷酸化發現,與單獨磷酸化相比,糖基化后蛋白的磷酸化程度提高,熱穩定性、乳化穩定性、和凝膠特性如硬度、彈性以及持水能力提高;Enomoto等[60-61]通過糖基化修飾β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳清蛋白(α-LA)并磷酸化,發現β-LG的視黃醇結合活性下降,而β-LG和α-LA的促進磷酸鈣的溶解能力提高。磷酸化后β-LG和α-LA的二級結構并未發生明顯的變化,而α-LA的色氨酸熒光強度減小,蛋白分子結構伸展。對生理活性的變化分析表明,β-LG的抗原性在糖基化后減小,而進一步的磷酸化對抗原性影響不明顯;糖基化和進一步的磷酸化均降低了α-LA的抗體應答,使α-LA對細胞促炎因子(IL-6和腫瘤壞死因子-α)的抑制作用進一步增強。此外,磷酸化修飾還使得的α-LA抑制細胞凋亡的能力提高。

2.4.2 葡萄糖-6-磷酸通過美拉德反應磷酸化 葡萄糖-6-磷酸(G6P)是主要的糖代謝產物,其羰基基團具有半縮醛鍵。由于G6P同時具有羰基和磷酰基的特性,可以通過氨基-羰基反應將磷酰基引入蛋白質分子中,從而作為安全的蛋白質改性試劑[62]。Aoki等[63]使用G6P通過美拉德反應磷酸化乳清分離蛋白和蛋清蛋白,發現前者褐變程度更大,G6P修飾的蛋白在鈣-磷溶液中可以有效的抑制磷酸鈣沉淀的形成。Kato等[64]分別使用葡萄糖(Glu)和G6P對卵白蛋白改性,結果表明G6P誘導的磷酸化蛋白質聚集和褐變程度更大,溶解性和耐熱性提高,且乳化活性與天然卵白蛋白相比提高了5倍。Aoki等[65]通過G6P磷酸化β-LG,發現β-LG的乳化活性和抑制磷酸鈣沉淀形成能力均提高。研究還發現G6P對β-LG改性的反應時間需要控制在1 d以內,因為G6P與蛋白氨基的反應在1 d內會快速進行,而超過1 d反應速率下降,且褐變與聚合產生的副產物會變得更加穩定。

通過美拉德反應對蛋白質進行磷酸化的方法雖然在一定程度上提高了蛋白的磷酸化程度和反應效率,但美拉德反應所引起的蛋白褐變及蛋白分子間聚集仍是一個亟待解決的問題。

3 結論與展望

隨著食品工業發展對蛋白質功能特性要求的提升,通過酶法或者非酶法對食品蛋白質進行磷酸化修飾以獲得專項功能較好或多種功能特性達到平衡點的蛋白衍生物,并作為天然的食品添加劑用于改善食品的口感與質地、為食品體系補充必要功能,從而為蛋白質資源的進一步開發利用提供了良好的思路。酶法磷酸化可以在溫和條件下實現蛋白質的磷酸化,具有較好的安全性,可以在一定程度上提高蛋白質的功能性質。但是由于磷酸化的蛋白激酶種類較少,只能引入少量的磷酸基團,因此磷酸化效率低。此外,酶法磷酸化必須在消耗ATP的情況下發生磷酸激酶與底物的作用,而ATP和磷酸激酶的成本較高,限制了其在工業化生產中的應用。非酶法磷酸化中,高反應活性的磷酸化試劑(如POCl3、P2O5)容易生成副產物,導致蛋白質交聯生成賴丙氨酸,降低蛋白的營養價值。且反應產生的殘余試劑和副產物難以去除。在食品中允許使用的相對安全的磷酸化試劑,如焦磷酸鈉等誘導的磷酸化反應時間普遍較長,部分蛋白質的磷酸化程度低,磷酸化效率有待提高;而通過糖基化來提高磷酸化反應效率,則需要更長的反應時間,增加了成本,且褐變反應的發生影響了產品質量,降低了實際應用的價值。因此,尚需研究一種高效且溫和的磷酸化反應,可以根據特定的需求對蛋白質進行定向的磷酸化改性,以進一步擴展磷酸化在改性蛋白功能性質的應用。

由于磷酸化的反應特性,磷酸化修飾對改善多種食品蛋白質的乳化活性及凝膠特性上取得了明顯的效果,從而在食品親水膠體領域表現出替代小分子表面活性劑以穩定多相食品體系,提高蛋白凝膠的流變及質構特性、形成均勻且具有良好機械性能的蛋白水凝膠的潛在應用價值。并可進一步利用凝膠網絡結構為功能活性物質提供結合位點,或通過穩定的蛋白乳液體系包裹脂溶性功能因子,以提高功能因子的穩定性、最大程度的保持其功能活性,從而實現功能因子在體內的靶向輸送和定向緩釋。通過現有對蛋白質磷酸化修飾的研究,為闡明不同蛋白質在分子水平的磷酸化機制,深入理解食品體系結構-功能特性的內在聯系,提供了較好的理論基礎。使得在不久的將來,利用高效率的特異性磷酸化來定向改善食品蛋白質的功能特性成為可能。