仔豬腸道發育和氨基酸營養調控機制

譚碧娥，王婧，印遇龍

（中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙 410125）

腸道生長是仔豬生長發育的核心和快速生長的基礎。腸道是消化和吸收營養物質的主要場所，也是抵抗病原體的重要屏障。由于仔豬的腸道發育不夠健全，早期斷奶極易引起仔豬腸道黏膜屏障損傷及消化功能紊亂，繼而導致自由采食量下降，能量攝入不足，腹瀉，甚至死亡。通過優化仔豬日糧營養水平促進腸道發育，改善腸道黏膜損傷，是緩解仔豬早期斷奶應激的有效途徑[1]。氨基酸是小腸優先利用的重要營養物質，參與了細胞生長過程中各種重要的生理生化過程[2]，小腸黏膜氨基酸的利用對腸道發育和維持腸道健康具有重要作用。

1 仔豬腸道形態結構發育和斷奶適應性變化規律

仔豬腸道的發育過程主要分三個階段：1）胚胎期，腸道的初步形成與生長；2）哺乳期，腸道的快速發育；3）斷奶期，腸道的損傷與修復。

1.1 胚胎期腸道形成與生長

腸道的器官發生始于早期胚胎發育階段，由內胚層細胞遷移形成間質細胞環繞的簡單腸管，且腸管壁層存在增殖細胞[3]。隨后，由未分化細胞形成的層狀內胚層，經前端至尾端轉變為具有簡單柱狀上皮細胞的新生絨毛，絨毛細胞繼而分化為具有微絨毛結構、刷狀緣水解酶以及營養轉運載體的腸道上皮細胞。增殖細胞在初生絨毛之間的區域聚集，并侵入基底間質區形成原始隱窩[4]。隱窩中含有多能干細胞，在隱窩底部增殖，并沿著隱窩—絨毛軸遷移至絨毛頂端，在此過程中分化為吸收型上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和內分泌細胞[5]。此外，腸道上皮還存在M細胞和塔夫細胞[6]。絨毛由分化的腸上皮細胞排列形成后，胎兒開始吞咽并消化羊水，胎兒從羊水中吸取自身所需的10%～14%的營養和能量用于自身組織合成及發育[7]。除了營養物質，羊水中還包含了具有生物活性的非營養性物質，如生長因子和激素，對調節胎兒腸道發育至關重要。

1.2 哺乳仔豬腸道的發育

新生仔豬為了適應由宮內生長環境到獨立的宮外生長環境的轉變，腸道結構和功能發生了巨大的改變。仔豬出生后，初乳刺激腸道快速生長，主要表現為腸道DNA合成和蛋白含量增加，細胞周轉速率下降，并伴隨著絨毛及微絨毛表面積的擴張。出生后24 h小腸相對體重之比是出生時的2倍[8]，腸道隱窩深度與絨毛高度分別增加了40%和30%[9]，腸道消化面積增加了50%[10]。在初生的2～3天中，腸道上皮細胞攝取初乳中的蛋白質（免疫球蛋白、激素、生長因子等）并儲存在消化液泡中，使細胞體積急劇增大。隨著腸道逐漸成熟，消化液泡由近端空腸至遠端回腸慢慢消失，這一過程大約持續2～3周[11]。腸道通過折疊增加自身表面積，腸黏膜折疊形成縱向的環形皺襞，每個皺襞中包含多個隱窩—絨毛單位。仔豬出生后1周，腸黏膜血流量增加，絨毛長度也隨之提高，且絨毛表面逐漸出現大量的橫向溝紋，但隨著仔豬日齡的增加，絨毛變短變粗，絨毛橫向溝紋的數量與深度減少[11]。Wang等[12]發現，仔豬空腸微絨毛在1日齡時長、細且稀疏，隨著日齡的增長絨毛逐漸變為短、粗且密集，同時腸道杯狀細胞數逐漸增加（圖1）。仔豬14日齡時，絨毛由初生時的指狀變為舌狀，隱窩深度進一步加深，絨毛表面與7日齡相比變得光滑[13]。

1.3 斷奶仔豬腸道的損傷修復

圖1 不同日齡哺乳仔豬（1、7、14、21日齡）和14日齡早期斷奶仔豬（斷奶后第1、3、5、7天）空腸微絨毛結構（掃描電鏡，放大倍數× 200）（引自：Wang等[12]）Fig. 1 The structure of jejunal microvillus in 1, 7, 14, 21-d-old suckling piglets and piglets on days 1, 3, 5, 7 post-weaning at 14 d of age (scanning electron microscopy, magnification × 200) (Quoted from Wang et al. [12])

在斷奶階段，仔豬腸道面臨著許多應激因子，影響著腸道形態結構和生長發育[9]。斷奶應激造成腸黏膜結構和功能損傷，誘導腸道紊亂和腹瀉[14-15]。在斷奶后的前2天，腸黏膜相對重量（相對于體重）可下降20%～30%[16]，腸黏膜屏障損傷最嚴重發生在斷奶后的第3～5天[14,17]。腸黏膜屏障受損主要表現為腸道絨毛萎縮，仔豬21日齡斷奶后24 h內，絨毛高度降低了75%，絨毛高度與隱窩深度比也隨之降低。14日齡斷奶仔豬空腸和回腸絨毛的高度和密度在斷奶第3 天明顯降低，隨后在第7天逐漸恢復（圖1）。同時，14日齡早期斷奶導致了斷奶后第3天和第5天空腸中E-cadherin和occludin的基因表達量以及occludin和ZO-1的蛋白水平顯著降低，腸道屏障功能受損[12]。伴隨著絨毛高度的降低和隱窩深度的增加，腸道刷狀緣酶活也在斷奶后的第4～5天降至最低值[18]。

腸道黏膜具有損傷后快速修復的能力[19]。腸黏膜屏障在斷奶后第5～10天才恢復至正常水平[16]。Hu等[14]發現，絨毛高度和隱窩深度在斷奶后的第14天可恢復至斷奶前水平。仔豬腸道損傷后的修復是一個十分復雜的過程，包括了腸上皮細胞的重建、細胞增殖、凋亡、血管再生與黏膜重塑[20]。小腸絨毛的萎縮主要是由于腸道細胞增殖速度緩慢，以及大量成熟腸細胞在絨毛頂端脫落。腸道絨毛高度的降低導致了腸道上皮細胞從隱窩底部至絨毛頂端遷移距離 （EMD）縮短，EMD在斷奶第5天時顯著降低。EMD的縮短使腸上皮細胞遷移速度加快，與斷奶第0天比，腸上皮細胞遷移速度在斷奶后第2、4、8天時分別加快了1.86、3.42和2.60倍[21]。腸黏膜損傷的快速重建，主要依靠已分化的腸上皮細胞而非隱窩區域未分化的細胞[22]。鉀離子通道的激活與多種細胞的生長或分化有關[23]。斷奶后鉀離子通道表達量的增加，在損傷后分化的腸上皮細胞的遷移過程中具有重要作用[12,22]。細胞內多胺與腸黏膜的生長和修復進程密切相關[24]。仔豬斷奶后的第1～3天空腸和回腸中亞精胺和精胺濃度增加，腸道多胺合成過程中的第一限速酶ODC基因和蛋白表達在斷奶第3天顯著升高[12]，可以作為腸道損傷修復的指征。

2 仔豬腸道黏膜上皮細胞氨基酸的代謝利用

2.1 腸道氨基酸代謝

日糧蛋白質在被運輸到腸細胞之前在消化道中被水解成小肽和游離AA[25]。日糧中20%～97%的AA被小腸首過代謝，只有低于20%的AA用于腸黏膜蛋白質合成[3]。進入腸道中的幾乎所有谷氨酸和天冬氨酸，67%～70%的谷氨酰胺，30%～40%的脯氨酸和35%的支鏈鏈(BCAA)被豬小腸分解[26-27]。許多研究結果表明，氨基酸而非血糖是小腸黏膜的主要能量來源[2]。Reeds等[28]采用外科手術和同位素技術研究發現，盡管小腸黏膜細胞攝取了大量的葡萄糖，但大多用于糖原的合成，僅5%被黏膜利用。日糧谷氨酰胺及與谷氨酰胺代謝有關的天冬氨酸、谷氨酸不僅為小腸黏膜提供能量，也是細胞的蛋白質、核酸及氧化型輔酶Ⅱ（NADP+）等物質合成的前體和促進劑，對維持黏膜的正常形態、結構和功能具有重要作用[28]。體外培養的豬腸上皮細胞利用谷氨酰胺的基礎代謝和ATP生成均高于葡萄糖，驗證了腸上皮細胞優先利用谷氨酰胺作為能量來源的結論[29]。Yao等[30]發現，α-酮戊二酸（AKG）對腸道功能性氨基酸代謝具有節約效應。作為連接細胞內碳氮代謝的關鍵節點，AKG可直接進入三羧酸循環為腸道提供能量并劑量依賴性地抑制腸上皮細胞對谷氨酰胺和谷氨酸的降解，降低丙氨酸、天冬氨酸、氨和二氧化碳等代謝產物的形成，使更多的谷氨酰胺和谷氨酸用于機體蛋白質的合成。腸道內的細菌也會吸收和降解游離AA和小肽，產生氨、CO2、多胺、核苷酸、蛋白質和其他氮源 (包括亞硝酸鹽、硝酸鹽和谷胱甘肽)。腸道細菌能降解所有的AA，主要涉及小腸中賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸和組氨酸的分解代謝[31-33]。

2.2 腸道氨基酸吸收和感應

仔豬出生后3 h內，單位質量腸黏膜中天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和脯氨酸的吸收率顯著下降；隨后，脯氨酸吸收率顯著增加，至7日齡達到最大值后逐漸降低，至28日齡脯氨酸吸收率趨于穩定水平。氨基酸轉運速度的降低可能是由于腸黏膜單位面積內氨基酸轉運載體的減少造成的，Yang[34]發現空腸中氨基酸轉運載體B0AT1、ATB0和EAAC1的表達水平隨著仔豬年齡增加而減少。但是天冬氨酸、蛋氨酸和賴氨酸的吸收率隨著日齡的增長顯著增加，至28日齡增加至最高值[35]。斷奶應激降低了所有氨基酸的攝取率。仔豬出生后腸道的快速生長促進了腸道總氨基酸吸收能力的增加，斷奶后出現的腸道絨毛萎縮和黏膜損傷會導致腸道氨基酸攝取率的短暫下降[35]。

腸道氨基酸的吸收由氨基酸轉運載體介導。氨基酸轉運載體可以調控氨基酸進入細胞內作用于相應的受體，或直接啟動細胞信號，調控細胞內生理過程。Na+依賴性中性氨基酸轉運載體SNAT2作為近年來發現的氨基酸轉運感受體的典型代表，在調控氨基酸信號感應中發揮重要作用[36]。氨基酸饑餓、精氨酸、谷氨酸或亮氨酸能誘導腸上皮細胞SNAT2的表達，而谷氨酰胺抑制其表達；采用mTOR RT2Profiler PCR Array分析發現，SNAT2抑制后主要調控mTORC1上游調控因子；抑制SNAT2顯著降低細胞增殖和蛋白合成[36]。PATs、CasR和T1R1/T1R3也是重要的氨基酸感應受體。PAT1不僅能夠將胞外氨基酸直接轉運入胞漿內，還能夠作用于mTORC1[37]。PAT1能促進質子依賴性氨基酸的轉運，促進腸腔蛋白質在腸道刷狀膜緣酸性小環境的消化[38]。T1R1/T1R3作為直接感受機體能量狀態和胞外氨基酸濃度的感受器，敲除后會直接影響氨基酸濃度作為信號傳遞到mTORC的過程[39]。此外，腸道微生物和宿主通過代謝感應也能調控氨基酸的利用。Ren等[40]發現，病原菌ETEC感染情況下，微生物發生了顯著的變化，L.lactissubsp.lactis增加，進而通過產生γ氨基丁酸（GABA）激活腸道免疫信號；GABA轉運載體2通過調控GABA從細胞外轉至胞內而終止GABA信號（圖2）。

圖2 腸道微生物和宿主互作調控腸道免疫反應機制Fig. 2 The mechanisms of interactive regulation of intestinal microbe and host on immune responses

3 功能性氨基酸對仔豬腸道結構和功能的調控作用

氨基酸在腸道的代謝對營養和健康有重要意義[41]。本課題組大量研究證明，氨基酸尤其是功能性氨基酸在黏膜代謝和損傷修復中具有關鍵作用[29,42-47]。每天食入的谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和血液谷氨酰胺進入腸黏膜后，成為小腸能量的主要來源，為小腸養分的主動轉運和蛋白質周轉提供足量的ATP。在腸黏膜應激損傷修復過程中，精氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸等可作為線粒體能量基質被利用，促進腸上皮細胞DNA合成和損傷修復[48]。Xiao等[49]研究發現，N-乙酰-L-半胱氨酸能促進H2O2誘導損傷的腸上皮細胞的線粒體生物合成，改善細胞TCA循環，減少細胞凋亡和死亡（圖3）。

精氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸是合成多胺的前體物，多胺與DNA、RNA以及蛋白質的生物代謝有關，在細胞分化、細胞周期的調節中起關鍵作用，對新生仔豬細胞增殖和分化至關重要，是小腸黏膜生長、發育、成熟、適應恢復所必需的物質[50]，可促進腸腺隱窩細胞的增殖、分化和移行，促進腸黏膜的損傷修復[22]。Wang等[51]研究發現，哺乳仔豬灌服腐胺和脯氨酸提高斷奶后小腸黏膜多胺濃度和ODC蛋白表達，促進小腸黏膜細胞增殖和分化，從而促進黏膜成熟；脯氨酸顯著提高空腸ZO-1、occludin和claudin-3以及回腸 ZO-1和claudin-1的蛋白表達，促進黏膜屏障功能。

圖3 氨基酸促進腸道DNA合成和蛋白質合成的通路Fig. 3 The pathway of amino acids improving DNA and protein synthesis in the intestine

mTOR可調控氨基酸利用，從而作為腸道功能調控的靶標，調控作用包括蛋白質合成、免疫反應、線粒體功能、細胞增殖分化凋亡等[40,42,52-53]。精氨酸和Ala-Gln等通過激活mTOR信號通路促進腸上皮細胞質蛋白質合成（圖3），同時抑制了泛素蛋白酶途徑UBE3A基因表達而抑制蛋白質降解，從而促進損傷修復[42,53]。精氨酸和GABA等可激活mTOR通路，調控機體免疫功能[40]。精氨酸通過調控細胞因子和抗體產生提高腸道免疫功能[52]；通過抑制了TLR4活性和NFκB的磷酸化，從而抑制LPS誘導的TLR4-NFκB信號通路，緩解腸上皮細胞炎癥損傷[42]。GABA能被Th17細胞通過GABA受體感應，從而激活mTOR信號通路，通過mTORS6K1-EGR2-GFI1通路影響腸道的Th17的活化以及IL-17的表達；抗生素處理情況下，補充高劑量GABA降低了ETEC感染下IL-7的表達[40]（圖2）。

腸道氨基酸轉運感受體作為氨基酸營養信號傳導的重要環節，對腸道功能維持發揮重要作用。轉運感受體感應胞外的刺激及激活胞內信號, 影響腸道上皮細胞的增殖分化與功能[54]，還與腸道防御機制相關。其中鈣敏感受體CaSR在維持和恢復腸道穩態方面發揮著關鍵作用，激活CaSR可以刺激腸黏膜屏障再生[55]。芳香族氨基酸包括L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸作為CaSR的變構激動劑，通過激活CaSR信號通路緩解LPS誘導的仔豬腸道炎癥反應[56]（圖4）。在腸細胞中芳香族L-色氨酸能夠通過激活CaSR信號通路募集β抑制蛋白2抑制NF-κB信號通路，阻斷炎性信號轉導，從而發揮抗炎的作用[57]。

圖4 色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸（TPT）調控腸道炎癥反應的機制Fig. 4 The mechanisms of tryptophan, phenylalanine and tyrosine (TPT) regulating intestinal inflammatory response

4 展望

腸道氨基酸的代謝對腸道發育和健康調控具有重要意義。腸道氨基酸的利用過程涉及胃腸道對蛋白質的消化、腸道及其微生物對蛋白質/氨基酸的代謝利用等環節，需要進一步深入研究神經內分泌對上述生理過程的調控。采用整合生理學方法研究腸道—肝臟—肌肉等多器官的協同代謝網絡，以及神經內分泌對代謝網絡的整合調控機制；將微生物與宿主作為一個整體開展研究，在腸道及其微生物互作影響蛋白質/氨基酸利用方面取得理論突破。此外，深入研究氨基酸感應信號途徑，鑒定新的分子調節靶點，為腸道代謝紊亂等營養代謝失衡疾病的調控提供依據。靶向開發營養調控劑，研究其對仔豬腸道發育和健康的調控機制，為提高仔豬生產力提供新方法和技術。