界面物理化學特性在動物營養消化研究中的應用與展望

湯少勛，黨坦，譚支良

（1. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，農業部中南動物營養與飼料科學觀測實驗站，湖南省畜禽健康養殖工程技術中心，湖南 長沙 410125；2. 中南大學冶金與環境學院，湖南 長沙 410083）

瘤胃微生物對纖維物質的高效降解是反芻動物高效利用粗飼料資源的根本原因，并因其能緩解人畜爭糧矛盾而倍受關注。飼料纖維或營養物質的消化利用是一個非常復雜的過程，涉及到物理、化學、生物學等過程。在傳統動物營養學研究中，對飼料纖維物質的降解或營養物質消化利用的研究主要集中在對飼料化學組成、腸道微生物種類與組成、營養物質與宿主間的關系等，在解析飼料營養物質消化與利用的復雜過程與機制方面，還面臨著系列難點與考驗，急需新的理論與技術對現有理論進行豐富和完善。界面物理化學是研究物質在多相體系中其表面特征，以及發生在其表面的物理與化學過程及其規律的科學，其研究方法目前廣泛應用于材料學、環境學、土壤學、高分子化學、日用化工、精細化工、生命科學和藥學等領域。而消化道微生物或消化液對營養物質的降解和消化同樣是建立在微生物或消化液與營養物質間界面基礎上進行的。如瘤胃細菌對纖維物質降解利用的首要條件是與纖維物質發生作用[1]，在緊密黏附于纖維物質表面的基礎上對其進行降解利用[2-3]。瘤胃細菌通過向纖維底物運移，進而在底物表面分別發生非特異性與特異性黏附，并進行增殖，且每一過程都以前一過程的順利完成為基礎[4]。并認為細菌對底物的粘附作用受其表面物理化學特性的影響[5-6]。

另一方面，微生物及酶對營養物質的利用基本都是在液體環境條件下進行的，這樣在飼料營養物質消化及利用過程中就存在微生物與飼料營養物質間的固－固界面，以及營養物質與消化酶或微生物與其生存媒介間的固－液界面。發生在這些界面之間的物理化學特性的變化與營養物質的消化或降解間可能存在一定的關系。有研究認為細菌表面活性與質子離解或結合引起的環境條件（pH，離子強度及疏水性）的改變密切相關[7]。發現細菌在低離子強度溶液中接近底物表面時存在細菌無法克服的能量屏障[8-9]，在中等離子強度的溶液中，細菌與底物表面的距離僅幾十毫微米，細菌對底物的捕獲是可逆的。而在高離子強度下，靜電的作用受到強烈抑制，細菌與底物的互作在不同距離下都表現出凈吸引的現象，并導致不可逆的吸附[10]。O’Sullivan等[11]對纖維降解菌中厚壁菌門的三種梭菌降解纖維過程中群落富集特征的研究結果表明，纖維降解速率主要受細菌表面膜結構，以及底物可供細菌定植的表面積的影響。這些研究結果表明，營養物質降解過程中微生物及底物的界面物理化學特性的變化與營養消化密切相關。因此，解析飼料底物界面特性、微生物自身界面特性，以及微生物生存媒介界面特性變化與飼料營養消化降解間的關系，對深入理解飼料營養的消化利用機制具有重要意義。本文從飼料底物界面特性、微生物自身界面特性，以及微生物生存媒介界面特性變化與飼料營養消化降解間的關系進行綜述，以期為豐富動物營養學理論提供參考。

1 營養底物界面特性在營養消化過程中的作用

1.1 飼料比表面積

腸道微生物對飼料營養的分解利用不僅與其化學組成有關[12-13]，而且與飼料表面的物理化學特性有關[14]。有研究表明，腸道微生物降解飼料的首要條件是與飼料顆粒表面可降解位點進行結合，在飼料物理性質中，飼料顆粒比表面積（special surface areas，SSA）與飼料顆粒大小，以及飼料可降解位點的數量密切相關，飼料顆粒的比表面積越大，意味著可供微生物吸附的可降解位點數也越多，進而飼料越易被降解。因此，在飼料界面的理化性質中，其顆粒的比表面積是影響瘤胃細菌纖維降解效率的一個重要因素[15]。

飼料顆粒的比表面積是反映飼料顆粒物理特性的一個重要指標，它是指單位質量物質的總表面積，即每克物質總表面積。底物比表面積越大，其表面效應（如表面吸附能力、可吸附位點等）越強。有研究發現，瘤胃纖維物質的消化主要受纖維細胞壁上可供纖維素酶作用位點數的限制，而不是受纖維降解菌的濃度的限制[15]。由此可見，當瘤胃中降解細胞壁的微生物達到一定數量時，飼料的消化過程就主要受飼料顆粒表面可供微生物定植和侵襲面積的限制。高巍[16]研究發現，提高植物飼料顆粒表面積可顯著增加纖維降解菌在飼料顆粒表面附著的數量以及木聚糖酶的活性。Maaroufi等[17]研究發現，在體外發酵中，粉碎豌豆累積產氣量、pH值、氨態氮和可溶性碳水化合物濃度的變化與豌豆顆粒比表面積存在顯著相關性。提高粉碎細度會提高累積產氣量，但降低pH值和可溶性糖濃度。劉勇等[18]研究了不同比表面積稻草秸稈體外發酵特性，發現提高發酵底物（稻草中性洗滌纖維）的比表面積可有效提高稻草纖維物質的消失率和氨氮濃度。Weimer等[19]研究報道稱，纖維素降解速率與纖維素總比表面積呈強烈正相關（R2=0.978）。Miron等[4]認為粗飼料顆粒越小，其比表面積就越大，粗飼料顆粒表面供纖維分解菌及酶作用的有效面積也越大，進而更有利于纖維物質的降解。

對不種類飼料顆粒比表面積的研究發現，在相同粉碎粒度下，不同粗飼料原料樣品的比表面積存在顯著差異，農作物秸稈中以水稻秸稈的比表面積最高，然后依次為小麥秸稈和玉米秸稈。來自這些秸稈的中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）以及酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）的比表面積按水稻秸稈＞小麥秸稈＞玉米秸稈的順序依次減小。而且秸稈飼料比表面積隨粉碎細度的增加而增加[20]。研究結果說明，引起不同品種飼料營養消化特性差異的原因可能不僅與化學成分密切有關，而且與其比表面積有關。因此在飼料消化評價過程中，飼料顆粒的比表面積也是一個不可忽視的因素，但其對飼料消化的貢獻率有待更多的研究加以明確。

表1 不同來源和顆粒大小粗飼料原料及纖維比表面積（m2/g）（引自：黨坦等[20]）Table 1 Specific surface area (m2/g) of original and fiber samples of forage at three levels of particle size

1.2 陽離子交換量

在飼料纖維多聚物表面含有許多羧基、氨基、去脂肪羥基和酚類羥基等功能性基團，所有這些基團都具有與金屬離子相結合的能力。在一定的pH條件下，單位細胞壁纖維多聚物與某種金屬離子相結合的能力就稱為飼料纖維的陽離子交換量（cation exchange capacity, CEC）。彭藝等[21]對我國反芻動物常用三類飼料的CEC值的測定發現，不同類型飼料的陽離子交換量的變化范圍較大，而同一種類飼料不同品種間陽離子交換量變化較小。其對28種飼料的CEC值與化學成分的進一步研究發現，飼料的陽離子交換量與其粗蛋白及木質素含量存在極顯著的正相關關系，而與其NDF、ADF 和纖維素含量存在顯著負相關關系，與其它化學成分的相關性不明顯或沒有相關性。

有研究表明，飼料的陽離子交換量能影響反芻動物瘤胃緩沖性能、微生物對纖維的發酵和消化、以及機體內微量元素的平衡等[22-23]。Salimei等[24]研究發現，體外發酵48 h后粗飼料干物質降解率與粗飼料CEC值存在負相關關系，粗飼料NDF的CEC值與半纖維素消化率相關性不顯著。而粗飼料發酵延滯時間則與粗飼料CEC值存在正相關性。彭藝等[25-26]研究發現，不同CEC值日糧在綿羊十二指腸與直腸的流通量和消化率存在顯著差異，各種營養物質的流通量隨著日糧CEC值的升高呈逐漸下降的趨勢，而營養物質的消化率卻呈逐漸上升的趨勢。因此，在評價飼料營養價值中，可以把飼料陽離子交換量作為一個理化指標來評價飼料纖維的消化特性。

2 消化液界面特性在營養消化過程中的作用

2.1 表面張力

表面張力是指液體表面任意二相鄰部分之間垂直于它們單位長度分界線相互作用的拉力。工業微生物領域的研究發現液體表面張力與微生物在固體表面的粘附能力間存在相關性[27]。瘤胃微生物在降解飼料過程中一般都存在于液體環境，瘤胃液表面張力的改變是否也會影響飼料的降解或微生物的功能？

很多研究文獻報道證實，在日糧中添加非離子表面活性劑可促進厭氧真菌和細菌的生長、刺激纖維素降解酶的釋放、增強酶活性、促進底物與酶的附著[28-30]。這可能與非離子表面活性劑能改變消化液的表面張力有關。劉勇等[18,31]在纖維物質的體外發酵研究中發現，發酵液表面張力的變化對纖維物質的體外發酵特性有直接影響。當發酵液表面張力降低至36 mN/m時，極顯著降低中性洗滌纖維的消失率，并影響瘤胃微生物膜通透性及微生物表面疏水性。黨坦[32]研究發現，瘤胃液表面張力與秸稈干物質消化率間存在顯著的正相關關系。筆者對不同表面活性劑在相同表面張力條件下的體外發酵研究結果表明，相對表面活性劑的種類，表面張力對粗飼料發酵模式（表2）以及微生物膜通透性和干物質消失率（表3）的影響更為明顯。

表2 非離子表面活性劑及表面張力對粗飼料體外發酵發性脂肪酸產量與組成（%）的影響Table 2 Effects of alkyl polyglucoside and surface tension on volatile fatty acid production (mol/L) and molar ratio (%) for forage fermented in vitro.

表3 非離子表面活性劑及表面張力對粗飼料體外發酵特性與細胞膜通透性的影響Table 3 Effects of alkyl polyglycoside and surface tension on in vitro fermentation charateristics and membrane permeability of rumen microbe

微生物在代謝過程中產生的代謝產物具有良好的表面活性特性，可有效降低液體表面張力[33]。根據Traube規則，同一種溶質在低濃度時表面張力的降低效應與濃度成正比，并且在低濃度時增加濃度對表面張力的影響比高濃度時顯著[34]。瘤胃微生物在其生長代謝過程中產生的某些代謝產物表現出一定的表面活性（如降低界面張力、滲透、潤濕、乳化、分散等）。張秋卓[35]研究發現，稻草秸稈在生物降解過程中添加生物表面活性劑時對秸稈的降解可以起到增效作用。消化液表面張力在多大程度上影響飼料的消化與降解，以及微生物的功能，還需要更多研究加以明確。另一方面，消化道微生物代謝過程中產生的生物活性劑在飼料消化過程中產生多大的貢獻也需要更多研究加以詮釋。

2.2 氧化還原電位

氧化還原電位（oxidation reduction potential, ORP）是用來反映溶液中所有物質表現出來的宏觀氧化—還原性。電位為正表示溶液顯示出一定的氧化性，氧化還原電位越高，氧化性越強，為負則說明溶液顯示出還原性，電位越低，則還原性越強。瘤胃內ORP是反映瘤胃內環境的重要指標，其動態變化與微生物的數量和代謝強度，以及pH值密切相關。Baldwin和Emery[36]研究認為，瘤胃中與細菌細胞有關的還原物質的比例相當低，發現瘤胃ORP與瘤胃pH值存在一定的等量關系，并認為瘤胃液的還原性特性也可如pH值一樣作為衡量發酵效率的指標。Barry等[37]研究發現，給綿羊飼喂兩種日糧時瘤胃ORP沒有顯著差異，但一天之內ORP的變化顯著，并在飼喂前主要表現出氧化性，而在飼喂后主要表現出還原性。覃春富[38]研究發現，玉米秸稈日糧組瘤胃液ORP值顯著小于混合粗飼料組。而華金玲等[39]研究發現，日糧精粗比不影響山羊瘤胃液的ORP值。陳偉[40]的研究也發現不同粗飼料間瘤胃培養液的氧化還原電位存在顯著差異，且發現瘤胃培養液的氧化還原電位與乳酸和乙丙比間存在顯著正相關關系，而與pH值、乙酸、丙酸、總揮性脂肪酸及氨態氮存在顯著的負相關關系。而薛豐[41]研究發現，瘤胃液ORP隨粗飼料品質的提高具有下降的趨勢，但不同粗飼料間沒有顯著差異。蔡麗媛[42]對熱應激條件下山羊瘤胃發酵的研究表明，熱應激條件下山羊瘤胃ORP顯著上升，從非熱應激條件下的-253.1 mV上升到熱應激下的-153.3 mV，同時瘤胃內纖維素酶活性及總VFA產量顯著下降。姜岷等[43]研究發現，在產琥珀酸放線桿菌厭氧發酵過程中添加氧化還原調控劑可提高細菌產丁二酸的速率及培養液中的菌體濃度。以上研究表明，瘤胃內氧化還原狀態與飼料營養和發酵模式、微生物的代謝以及瘤胃內環境的平衡存在密切關系，在評估飼料營養、微生物活性及瘤胃功能時，氧化還原電位可在一定程度上作為評價指標體系的一個指標。

3 微生物界面特性在營養消化過程中的作用

3.1 微生物表面疏水性

細菌表面結構組成特異性使其具有疏水性的物理特性，細菌在各種生物和非生物表面/界面的非特異性粘附，以及其對聚合物的降解受其表面疏水性（cell surface Hydrophobicity, CSH）的影響[5-6]。細菌表面疏水性與其表面組成特性（如菌毛、多肽等）及細菌種類密切相關，并受細菌的生長媒介條件（如媒介溫度與pH值）、細菌的生長期與表面結構，以及生物表面活性劑等因素的影響[44-45]。有研究認為，微生物表面疏水性是影響微生物吸附與相互凝集的重要因素[46]，疏水性細菌易吸附于疏水性基質表面，而親水性細菌則易吸附于親水性基質表面。醫學及工業領域的研究發現，細菌在物質表面（如口腔表面、礦物顆粒、上皮細胞和生物材料等）的吸附排列及流動性在很大程度上受其表面疏水性的影響[47]。劉勇[31]在動物營養領域的研究結果顯示，瘤胃細菌表面疏水性在發酵早中期受發酵底物表面特性的影響。Liu等[48]應用Expected Measurement Moving Average–Machine Learning (EMMA-ML) 模型，進一步分析了混合瘤胃微生物表面疏水性與纖維發酵指標間的線性關系，發現微生物細胞膜表面疏水性真實值高度依賴于纖維的消化率、氨氮濃度及微生物初期表面疏水性。黨坦[32]在不同粗飼料體外發酵研究中發現，瘤胃微生物表面疏水性不受粗飼料種類的影響，但受粗飼料種類與飼料顆粒大小互作的影響，即不同種類粗飼料隨其顆粒大小的改變，微生物表面疏水性的變化規律不一致。有研究認為細菌表面疏水性是影響兩相反應的重要因素之一，并與細菌對底物的黏附現象有關[49]。瘤胃中微生物組成非常復雜，其表面結構的差異也會引起其表面疏水性的不同。在飼料纖維降解與消化過程中，腸道微生物表面疏水性可作為一個理化指標來衡量其生物學功能。

3.2 微生物膜通透性

細菌細胞膜具有一定的流動性及通透性，適宜的流動性與通透性是保證細胞處于正常生理功能的重要條件，當細胞膜的流動性及通透性發生改變時，其生理功能也發生改變[51]。微生物在對底物吸附、生物膜形成，以及降解物質過程中涉及到微生物活性物質分泌、細胞膜的信號傳導、基因表達、營養吸收與代謝產物的排出、水分與離子的交換等一系列生理功能，而這些生理功能在很大程度上受微生物細胞膜通透性的影響[52]。有研究認為，日糧中添加非離子表面活性劑能提高飼料的降解或消化率，是由于非離子表面活性劑本身所具有的疏水結構可作用于細菌細胞膜，增加細胞膜的流動性及通透性，從而使胞內酶更容易流向胞外，進而提高消化能力[28]。黨坦等[32,50]的研究表明，不同種類粗飼料發酵48 h后瘤胃微生物細胞膜通透性存在顯著差異，還發現瘤胃微生物細胞膜通透性與干物質消化率存在顯著的二次曲線關系。其對不同種類粗飼料纖維發酵的研究結果表明，微生物細胞膜通透性與微生物蛋白產量及干物質消化率間存在顯著正相關關系，而與氨態氮的濃度間存在顯著負相關關系。這些研究結果表明消化道微生物細胞膜通透性與飼料的消化之間存在密切關系，微生物表面物理特性是衡量微生物生理功能的重要指標。Liu等[53]根據纖維體外發酵指標（不同時間點發酵液pH值，氨態氨濃度、中性洗滌纖維消失率及產氣量等），利用Box-Jenkins Operator和Covariance Perturbation Theory Operators理論，進一步構建了利用這些指標對瘤胃微生物細胞膜通透性的預測模型，對77 781個觀察值的分析表明，預測模型的敏感性、特異性及精確性都高于0.89，馬修斯相關系數大于0.78。以上研究結果表明，微生物膜通透性作為微生物細胞重要生理特性之一，在飼料營養消化利用過程中扮演重要的生物學功能，在研究飼料營養的消化利用機制過程中應給予必要的考慮。

表4 不同飼料干物質消失率、氨態氮含量及瘤胃微生物界面物理化學指標（引自：黨坦等[50]）Table 4 Dry matter disappearance, ammonia nitrogen content and interface physical and chemical characteristics of ruminal microbe of different forage

3.3 表面電動電位

細菌細胞表面電動電位或zeta電位（electrokinetic potential，ζ）是表征細菌細胞表面物理特性的指標之一，它與細菌的吸附和生物膜的形成有關，并在維持細胞膜的穩定性上具有重要作用[54]，且能影響細菌的吸附[55]等。細菌細胞表面電動電位的絕對值越高，形成的微生物體系越穩定；反之，微生物聚集程度就越嚴重，體系也更不穩定。研究發現死亡細菌表面電動電位絕對值更低[56]；Soni等[57]在不同營養基中培養E.coli，Salmonella Newport，Pseudomonas sp.等單菌，認為細菌在飲水中其表面電動電位表現出的種類差異與其生理狀態相關。有研究發現，細菌表面電動電位與溶液中離子濃度和pH值高度相關[44]。腸道微生物表面也具有相似的zeta電位特性，劉勇[31]和黨坦[32]在體外模擬瘤胃發酵培養中測得微生物表面zeta電位值在-24 mV至-40 mV之間，其進一步研究發現，瘤胃微生物表面電動電位不受秸稈顆粒比表面積的影響，但不同種類秸稈發酵后瘤胃微生物表面zeta電位存在顯著差異（表4）。目前應用表面zeta電位表征腸道微生物表面物理化學特性，以及腸道微生物表面zeta電位與營養消化利用間關系的研究還比較少，還需要更多研究明確其在動物營養學中的作用，以及其對微生物本身活性特征的影響等。

4 展望

1）進一步明確不同界面物理化學特性指標在動物營養中的生物學意義：在動物營養研究中，營養物質的消化利用，以及微生物的功能作用都有其明確的生物學意義，目前界面物理化學特性指標在動物營養學中的應用還剛剛起步，對其在營養學或生理學中的意義，或其作用與貢獻并不是十分明確，在今后的工作中應明晰界面物理化學特性指標與營養消化吸收及微生物功能與組成等的關系和作用，為從全新的角度解析營養消化利用的機制提供科學依據。

2）優化界面物理化學評價指標分析測定方法：目前界面物理化學評價指標的分析測定都是借鑒于其他學科的技術方法，生命科學或者說動物營養學領域有其自身的特點，這些指標的測定分析方法可能不完全適用于動物營養科學領域，在今后的研究中應對現有的方法進行進一步的改進和優化。

3）界面物理化學評價指標的豐富：飼料營養的消化與吸收過程首先是發生在飼料、微生物或腸道的表面，除文中提到的界面物理化學特性指標外，可能還存在其他界面物理化學特性指標，今后應加強與飼料消化、吸收及微生物功能密切相關的界面物理化學特性評價指標的發掘，為從更全面的角度解析營養的消化吸收機制提供更豐富的評價指標。