用于心肌鈣蛋白I檢測的微流控芯片*

李兆萌， 劉 沖， 李 揚， 徐朋朋， 王 堃， 李經民

(1.大連理工大學 機械工程學院，遼寧 大連 116024;2.大連理工大學 遼寧省微納米技術及系統重點實驗室，遼寧 大連 116024)

0 引 言

急性心肌梗塞的早期診斷對于此類疾病的治療具有重要意義[1]。在急性心肌梗塞最初發作的3～6 h內[2]，人體血液中的一種肌鈣蛋白—心肌鈣蛋白I(分子量22.5kDa(1Da=1.660 538 921×10-27kg/mol))的濃度從10 ng/mL左右迅速上升至50 ng/mL[3]，最終能夠高達550 ng/mL[4]。心肌鈣蛋白I的這種高濃度狀態將持續保持6～8天，這為急性心肌梗塞的診斷提供了一個較長的窗口期[5]。與肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白等其他生化標志物相比，心肌鈣蛋白I具有突出的心肌損傷特異性，被視為診斷急性心肌梗塞的金標準[6]。因此，在急性心肌梗塞的早期階段，對于濃度升高的心肌鈣蛋白I的高靈敏度檢測方法顯得特別迫切。

電化學酶傳感器在疾病診斷方面具有操作簡單、精度較高等優點[7]。微帶陣列電極不僅保持了單個微帶電極IR降小、擴散電流密度大和RC常數小等優點，并極大地提高了電流強度[8]。在醫學檢測中，要求檢測樣本體積小，且為了避免交叉感染需要使用一次性裝置，因此檢測通常和微機電系統(micro-electro-mechanical system,MEMS)相結合[9]。

本文設計了一種簡單可靠、靈敏迅速的電化學免疫傳感器，用于人體心肌鈣蛋白I的濃度檢測。這種傳感器由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)溝道片和集成了微帶陣列電極的玻璃片組成。傳感器所產生的電化學信號強度正比于心肌鈣蛋白I的濃度，可用于人體急性心肌梗塞的早期診斷。

1 實驗部分

1.1 微流控芯片設計

微流控芯片由一片PDMS溝道片(20 mm×6 mm×2 mm)和一片玻璃電極片(34 mm×11 mm×2 mm)組成，如圖1(a)所示。PDMS溝道片內部溝道的深度為50 μm，寬度為500 μm，長度為12 mm，體積為0.3 μL。玻璃電極片由工作電極、參比電極和對電極三電極系統組成，電極材料均為Au，如圖1(b)所示。其中，工作電極由25對微型梳指交叉電極組成，每個梳指的寬度為40 μm，長度為2 mm，間隔為80 μm。由于進行電化學檢測時，只使用梳指交叉電極的一半進行工作，故工作電極仍為微帶陣列電極。參比電極和對電極均為長2 mm、寬1 mm的長方形結構；電極末端焊盤長度為8 mm，寬度為1 mm。

圖1 微流控芯片和玻璃電極片

1.2 微流控芯片制造

玻璃電極片的制作過程(圖2)為：(a)在一片Pyrex耐熱玻璃上，依次濺射一層10 nm厚的鉻薄膜和200 nm厚的金薄膜；(b)在金薄膜表面旋涂一層BP212光刻膠，轉速為2 600 r/min,在85 ℃下前烘處理30 min；(c)利用曝光機在掩膜下對光刻膠進行紫外曝光，將光刻膠浸入0.5 % NaOH溶液中，進行顯影，在85 ℃下烘處理30 min；(d)利用1 g I2，5 g KI和50 mL H2O的混合溶液，腐蝕金薄膜；(e)利用H4CeN2O3和HClO4的混合溶液腐蝕鉻薄膜；利用丙酮去除掉殘余的光刻膠，得到金電極。

圖2 玻璃電極片制作流程

1.3 檢測原理

微流控芯片檢測心肌鈣蛋白I的為:首先，對和電極組裝之后的PDMS溝道進行硅烷化修飾，在其表面形成羧基基團，并將蛋白G固定于修飾好的硅烷層上。蛋白G可以和心肌鈣蛋白I包被抗體的Fc片段進行特異性結合，使得心肌鈣蛋白I包被抗體的Fab片段裸露出來并保持特定的方向。檢測時，包被抗體和心肌鈣蛋白I抗原充分結合并將其固定[10]，固定之后的心肌鈣蛋白I抗原和心肌鈣蛋白I檢測抗體(用堿性磷酸酶標記)進行特異性結合，使得三者之間形成三級夾心結構[11]。

實驗以對氨基磷酸苯酯(phenyl phosphor amidate,PPA)作為反應底物，對氨基磷酸苯酯(phenyl p-aminophosphate,PPAP)在堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)的催化作用下生成對氨基磷酸苯酚(phenol p-amino phosphate,PAP)，PAP在正電位作用下會生成醌亞胺(quinone-imine,PQI)[12]。利用循環伏安法進行檢測時，測得的循環伏安曲線中氧化峰的峰值和生成的PAP的濃度成正比，進而可以標定參與反應的心肌鈣蛋白I的濃度。

1.4 試劑材料

蛋白G(由G型鏈球菌分離而得，可以和抗體的Fc片段特異性結合)、對氨基磷酸苯酯購于英國Abcam公司。高錳酸鉀(KMnO4)、7—辛烯基三氯硅烷(C8H15Cl3Si)、三氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCL sodium)、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的小鼠免疫球蛋白G(IgG)購于美國Sigma-Aldrich公司。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)購于北京雷根生物技術有限公司。人體心肌鈣蛋白I抗原(cTnI)、小鼠心肌鈣蛋白I單克隆包被抗體(M18)、小鼠心肌鈣蛋白I單克隆檢測抗體(M4)于美國Fitzgerald公司購買。AP試劑盒購于英國Innova Biosciences公司，可以對小鼠心肌鈣蛋白I單克隆檢測抗體(M4)進行標記。

1.5 實驗過程

為了能夠將心肌鈣蛋白I包被抗體固定于PDMS溝道內表面，需要對溝道內表面進行硅烷化。硅烷化過程是利用C8H15Cl3Si,KMnO4溶液等對通道進行修飾，產生羧基基團。硅烷化后形成的羧基基團可以將蛋白G固定，剩余的羧基空位用牛血清蛋白溶液進行封閉。為了驗證抗體在PDMS溝道內表面的固著特性，實驗采用FITC標記的小鼠免疫球蛋白G和溝道內表面修飾后形成的蛋白G層進行有效結合，通過在激光共聚焦顯微鏡下圖像的熒光強度進行表征。具體方法如下：在對微流控芯片修飾形成蛋白G層之后，將FITC標記的小鼠免疫球蛋白G注入PDMS溝道中，保持10 min，用磷酸鹽緩沖液將沒有固定的小鼠免疫球蛋白G沖洗掉。將經過以上處理的芯片置于激光共聚焦顯微鏡下，采用10倍物鏡，激發波長設置為488 nm，觀察PDMS溝道內表面的熒光強度。

實驗的核心部分為驗證微流控芯片對于心肌鈣蛋白I的電化學免疫分析功能，具體操作流程如下：1)對微流控芯片修飾形成蛋白G層后，將心肌鈣蛋白I包被抗體(30 μg/mL)注入芯片中;2)將分析物心肌鈣蛋白I(10 ng/mL)注入芯片中；3)將堿性磷酸酶標記的心肌鈣蛋白I檢測抗體(10 μg/mL)注入芯片中；4)對芯片注入對氨基磷酸苯酯溶液(溶解在三氨基甲烷鹽酸鹽中，4 mmol/L)，利用電化學工作站檢測此時的循環伏安曲線。電化學工作站的掃描電壓范圍為-0.15～0.15 V，掃描頻率為100 mV/s。由于對氨基磷酸苯酯溶液在堿性條件下容易被氧化，并對光照非常敏感，故需要每天新鮮配置，且實驗需要在黑暗的環境下進行。

2 結果與討論

2.1 抗體在PDMS溝道內表面的固著特性

為了驗證抗體在PDMS溝道內表面的固著特性，本研究采用3組芯片進行對比試驗，以證明蛋白G與抗體的特異結合性能。1)芯片為空白組，不進行任何處理；2)芯片在PDMS溝道內表面硅烷化之后，直接固定BSA，不進行蛋白G修飾；3)芯片在PDMS溝道內表面硅烷化之后，進行蛋白G層修飾，剩余空位用牛血清蛋白溶液進行填補。分別向3組芯片中注入FITC標記的小鼠免疫球蛋白G，保持10 min，然后用PBS沖洗。將3個芯片分別在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度。

圖3(a)為第(1)組檢測不到熒光，因為FITC標記的小鼠免疫球蛋白G不能直接在PDMS溝道內表面固著。圖3(b)顯示第(2)組熒光強度有了稍微的增加，這表明牛血清蛋白可以和PDMS溝道內表面硅烷層上的羧基結合，阻止了小鼠免疫球蛋白G和溝道上羧基的結合。微弱的熒光強度說明FITC標記的小鼠免疫球蛋白G可能和形成的牛血清蛋白層發生了不明確的物理吸附。圖3(c)顯示了第(3)組芯片具有較強的熒光強度，這是由于FITC標記的小鼠免疫球蛋白G的Fc片段和蛋白G層發生了有效結合，證實了抗體在PDMS溝道內表面的有效固著。

圖3 PDMS溝道內表面共聚焦顯微鏡圖像

2.2 微流控芯片電化學免疫分析的性能評估

為了證實微流控芯片內部的酶反應過程，對芯片電化學免疫分析的性能進行評估，本實驗同樣設計了3組芯片，利用電化學工作站對其性能進行表征。1)對沒有硅烷化的芯片直接注入磷酸鹽緩沖液，測得此時的循環伏安曲線作為一個背景信號。2)在對微流控芯片修飾形成蛋白G層之后，按照上述實驗步驟，將包被抗體(30 μg /mL)通過蛋白G修飾層固定于硅烷化的PDMS溝道內表面，然后在芯片中依次注入心肌鈣蛋白I(10 ng/mL)、AP標記的檢測抗體(10 μg/mL)，用磷酸鹽緩沖液沖洗，測得此時的循環伏安曲線作為一個對比信號。3)在第二組的基礎上，對芯片注入對氨基磷酸苯酯溶液(溶解在三氨基甲烷鹽酸鹽中，4 mmol/L)，保持1 min，利用電化學工作站檢測此時的循環伏安曲線。

如圖4曲線A和B所示，第(1)組和第(2)組芯片各自的氧化還原反應產生的電流很弱，幾乎沒有峰值。表明這2組芯片中并沒有電活性物質產生，因而不會發生氧化還原反應。第(3)組芯片利用循環伏安法測得的氧化電流峰值為586 nA，(曲線C)。這表明在PDMS溝道內部對心肌鈣蛋白I包被抗體、心肌鈣蛋白I和心肌鈣蛋白I檢測抗體發生了成功有效的固著，并且標記的AP和底物對氨基磷酸苯酯發生了反應。

圖4 不同芯片的循環伏安檢測曲線

2.3 心肌鈣蛋白I的循環伏安曲線和檢測范圍

本文對微流控芯片的靈敏度和檢測范圍進行了確定。圖5給出了檢測芯片對于不同濃度的心肌鈣蛋白I的循環伏安檢測曲線以及相應的校準曲線，利用循環伏安法測得的氧化電流峰值隨著心肌鈣蛋白I濃度的增大而增大。其中，心肌鈣蛋白I包被抗體的濃度為30 μg/mL，堿性磷酸酶標記的心肌鈣蛋白I檢測抗體的濃度為10 μg/mL，心肌鈣蛋白I的檢測濃度范圍為1～1 000 ng/mL，所有修飾和檢測過程均按上述步驟進行。根據校準曲線計算所得到的心肌鈣蛋白I理論最低檢測限為0.4 ng/mL。

圖5 心肌鈣蛋白I循環伏安曲線(插圖為相應的校準曲線)

3 結 論

研制了一種用于檢測人體急性心肌梗塞早期階段心肌損傷標志物,即心肌鈣蛋白I的電化學生物芯片。通過研究證明，該芯片具有良好的電化學檢測性能和較高的檢測靈敏度。芯片所需檢測樣品體積為0.3 μL，從注入心肌鈣蛋白I到獲得電化學信號時長大約為8 min，心肌鈣蛋白I的理論最低檢測濃度為 0.4 ng/mL。整個芯片的制造與發展成熟的微加工技術相兼容，因此可以低成本批量化生產，這對于此類疾病的快速診斷具有重要意義。