蔓越莓花色苷的組成鑒定及抗氧化能力

宛美志，孟憲軍*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

蔓越橘又名蔓越莓、小紅莓，原名“鶴莓”，因蔓越莓的花朵形似鶴的頭和喙而得名，果實表皮鮮紅，果肉泛白，空心有籽，干物質含量高且質地較輕。蔓越橘屬于杜鵑花科越橘屬紅莓苔子亞屬，植株為常綠灌木，喜生長在潮濕寒冷、地質弱酸的泥炭土壤，主要集中分布在北美、北歐地區，全球產區不到4萬 英畝[1]。我國蔓越莓栽培區主要集中在大興安嶺地區、遼寧省和吉林省的東南部，這些區域具備蔓越橘生長所需要的土壤、溫度、光照、水分以及無霜期等環境條件。蔓越橘富含活性成分[2]、營養價值極高[3-5]。柯春林等[6]研究表明乙醇提取蔓越莓花色苷含量可達5.5%；Cesoniene等[7]研究表明不同性系野生蔓越莓花色苷含量為40.7～207.3 mg/100 g；蔓越莓花色苷具有抗氧化能力[6,8]（如清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力[9-11]、清除2,2’-聯氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-aminodi(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）自由基的能力[10]和還原鐵離子的能力[11-12]等）及基于抗氧化活性的其他生理功能。近年來，隨著食品科學和食品營養學等學科的發展，蔓越莓的營養價值得到普遍重視。本實驗通過對蔓越莓花色苷進行提取、純化、花色苷組成鑒定和抗氧化能力測定，為蔓越莓資源的發展、評價及利用提供理論依據。

超高壓輔助提取通常的壓力范圍在100～600 MPa之間。在保證食品安全性的前提下，超高壓提取具有提取時間短、提取率高、對生物活性物質影響小等特點[13-14]。目前超高壓提取被視為生物活性物質最具潛力的提取方式之一，已經成功應用到多糖[15]、多酚[16]、果膠[17]等活性成分的提取，但是利用超高壓提取技術提取蔓越莓花色苷鮮見報道。

高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用技術被廣泛應用于食品、生物、醫藥、化工、環境和有害物質殘留檢測等方面[18-19]。Gomes等[13]通過超高效液相色譜和質譜聯用技術鑒定出蔓越莓中7 種花色苷，分別為矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-阿拉伯糖苷。Cesonien?等[7]研究表明蔓越莓中包含6 種花色苷，其中以芍藥素-3-半乳糖苷最常見。Jin[20]和Wang Yifei[21]等在蔓越莓中鑒定出矢車菊素-3-葡萄糖苷等花色苷和楊梅素-3-葡萄糖苷等類黃酮類化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔓越莓產地為吉林省，鮮果采摘后保存在-80 ℃超低溫冰箱中，備用。

DPPH 美國Sigma公司；AB-大孔樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司；ABTS試劑盒、T-AOC試劑盒南京建成生物工程研究所；無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；鹽酸（分析純） 西隴化工股份有限公司；氯化鉀、無水乙酸鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MJ-BL25B3美的攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司；BSA224S型電子分析天平、PB-10型pH計 北京賽多利斯科學儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發儀、玻璃層析柱（18 mm×300 mm） 上海亞榮生化儀器廠；UV-1600型紫外-可見分光光度儀 北京瑞利分析儀器公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；BYGY5L型超高壓殺菌機 溫州濱一機械科技有限公司；SHZ-D（III）循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；HL-2恒流泵、BS-100A自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；Epoch型酶標儀美國博騰儀器有限公司；1100型HPLC-MS聯用儀美國Agilent公司；LG0.2真空冷凍干燥機 沈陽新陽航空速凍設備制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蔓越莓花色苷的超高壓輔助提取

參考李新原等[16]的方法稍作修改。稱取蔓越莓凍果于室溫條件下避光解凍，轉入攪拌機中打漿，準確稱取20 份5.0 g蔓越莓果漿無損失地轉移到PET真空包裝袋中，分別加入100 mL體積分數為60%乙醇溶液（用質量分數36%～38%的濃鹽酸將乙醇溶液調至pH值為2.0），塑封機封口，超高壓400 MPa，提取12 min，過濾，測定其吸光度，旋轉蒸發除去乙醇，所得花色苷濃縮液冷凍干燥成粉，-80 ℃避光密封貯存，使用時按需配制。

1.3.2 蔓越莓花色苷的常規溶劑提取

參考柯春林等[6]的方法稍作修改。稱取等質量的蔓越莓果漿于燒杯中，按照料液比1∶20（g/mL）加入體積分數60%乙醇溶液（用質量分數36%～38%的濃鹽酸將乙醇溶液調至pH值為2.0），保鮮膜封口，水浴溫度40 ℃，提取60 min，測定其吸光度。在此條件下所得蔓越莓花色苷樣品與超高壓輔助提取蔓越莓花色苷樣品作比較。

1.3.3 蔓越莓花色苷的純化

稱取一定量的AB-8大孔樹脂，依次用無水乙醇、質量分數5%鹽酸溶液、質量分數2%氫氧化鈉溶液進行預處理，預處理后的大孔樹脂采用濕法裝柱，樹脂填充體積為玻璃層析柱的2/3，以2 mL/min的流速將400 mL蒸餾水泵入層析柱進行平衡過濾，平衡后以2 mL/min的流速泵入由1.3.1節所得凍干粉配制的花色苷溶液，泵入量為大孔樹脂體積的1/2，然后靜置吸附12 h。待花色苷充分吸附后以4.3 mL/min的流速將800 mL蒸餾水泵入層析柱，洗去花色苷溶液中的蛋白質、多糖、無機鹽等雜質。用無水乙醇以2 mL/min的流速洗脫花色苷，收集洗脫液，重復過柱2 次，最終得到的洗脫液轉入旋轉蒸發儀濃縮除去乙醇，濃縮液冷凍干燥成粉，密封，避光貯存在-80 ℃冰箱中，備用。

1.3.4 花色苷含量測定

取1 mL花色苷溶液，分別用pH 1.0的氯化鉀緩沖溶液和pH 4.5的乙酸鈉緩沖溶液稀釋至10 mL，混勻后于室溫條件下靜置反應15～20 min，分別在波長520 nm和700 nm處，用1 cm比色皿測定吸光度，重復操作3 次，取平均值。采用示差法按照公式（1）、（2）計算蔓越莓花色苷的含量：

式中：ΔA為緩沖液稀釋后的吸光度；V為提取液體積/mL；n為稀釋倍數；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾質量449.2 g/mol；ξ為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數26 900 L/（mol·cm）；m為稱取樣品質量/g；b為比色皿厚度/cm。

1.3.5 花色苷提取率測定

將蔓越莓凍果于攪拌機中打漿，準確稱取5.0 g蔓越莓果漿，加入50 mL體積分數60%乙醇溶液（用質量分數36%～38%的濃鹽酸將乙醇溶液調至pH值為2.0），混勻，超高壓400 MPa，提取時間12 min，過濾，濾渣重復提取2 次，合并濾液，取1 mL濾液，采用pH示差法按照公式（1）、（2）計算蔓越莓總花色苷的含量。超高壓輔助提取蔓越莓花色苷的提取率是指粗提液中花色苷含量與蔓越莓總花色苷含量的百分比，按公式（3）計算：

式中：C1為超高壓輔助提取蔓越莓花色苷粗提液中花色苷含量/（mg/g）；C總為蔓越莓總花色苷含量/（mg/g）。

1.3.6 花色苷組成鑒定

準確稱取10 μg 1.3.2節中所得凍干粉，用色譜級甲醇稀釋至2 mL，經0.45 μm濾膜過濾，待測。

HPLC條件：1100型HPLC儀（配G4212B二極管陣列檢測器）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈；流動相B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～45 min，0%～45% A；45～50 min，0% A；流速0.7 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；檢測波長520 nm。

MS條件：正離子模式，全自動二級質譜掃描；質量掃描范圍m/z 50～1 000；干燥氣壓力40 psi；流速12 L/min；溫度350 ℃；毛細管電壓3 500 V。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定

參照呂春茂等[22]的方法稍作修改。用無水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液，稱取1.3.2節所得花色苷凍干粉配制成不同質量濃度的待測液，100 μL花色苷待測液加入100 μL DPPH溶液，混勻后于室溫避光放置30 min，在波長517 nm處測定吸光度為A1，無水乙醇溶液代替花色苷溶液測定吸光度為A0，無水乙醇代替DPPH溶液測定吸光度為A2；以同質量濃度VC作陽性對照。根據公式（4）計算DPPH自由基清除率：

1.3.8 ABTS+·清除能力測定

稱取1.3.2節所得花色苷凍干粉配制成不同質量濃度的待測液，根據試劑盒方法配制ABTS工作液，200 μL ABTS工作液加入10 μL花色苷待測液，混勻后室溫孵育6 min，在波長734 nm處測定吸光度，以同質量濃度VC作陽性對照，以Trolox代替花色苷測定吸光度作標準曲線，根據標準曲線計算花色苷待測液的ABTS+·清除能力。

1.3.9 總抗氧化能力測定

參照安小琦等[23]的方法稍作修改，稱取1.3.2節所得花色苷凍干粉配制成不同質量濃度的待測液，以同質量濃度VC作陽性對照，按照T-AOC試劑盒說明書加入試劑，在波長520 nm處測定吸光度。T-AOC測定原理為花色苷和VC能使Fe3+還原成Fe2+，Fe2+與菲啉類物質絡合，通過比色法測定抗氧化能力。在37 ℃時，每分鐘每毫升花色苷溶液，使反應體系的吸光度，每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位（U）。根據公式（5）計算總抗氧化能力：

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復操作3 次，采用Excel 2007軟件對數據進行整理繪圖，SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析（Duncan’s差異顯著性分析），P＜0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 2 種方法提取蔓越莓花色苷含量、提取率及提取條件的比較

采用pH示差法測得超高壓輔助提取蔓越莓花色苷含量為（75.49±0.43）mg/100 g，常規溶劑提取蔓越莓花色苷含量為（67.31±1.08）mg/100 g；蔓越莓中總花色苷含量為（79.52±0.50）mg/100 g。如表1所示，超高壓輔助提取蔓越莓花色苷提取率為（94.92±0.54）%，常規溶劑提取蔓越莓花色苷提取率為（84.65±1.36）%。與常規溶劑提取法相比，超高壓輔助提取法時間短，操作條件溫和（不需加熱），提取率顯著高于常規溶劑提取法，因此，采用超高壓輔助提取蔓越莓花色苷更合適。1.3.1節中所得粗提物凍干粉的花色苷含量為（46.10±0.92）mg/g，經AB-8大孔樹脂純化后，所得純化物凍干粉的花色苷含量提高到（309.26±2.37）mg/g。

表1 不同方法提取條件及提取率的比較Table 1 Comparison of extraction conditions and anthocyanin yield by different extraction methods

2.2 蔓越莓花色苷HPLC-MS聯用分析鑒定結果

圖1 蔓越莓花色苷色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of cranberry anthocyanins

圖2 芍藥素-3,5-二己糖苷質譜圖Fig. 2 Mass spectra of peonidin-3,5-dihexoside

表2 HPLC-MS鑒定蔓越莓花色苷種類Table 2 Identi fi cation of cranberry anthocyanins by HPLC-MS

通過HPLC-MS聯用技術對蔓越莓花色苷進行組成鑒定，如圖1、2，表2所示。結合各物質的色譜保留時間、分子離子峰和碎片離子峰，鑒定出蔓越莓中主要有7 種花色苷，與Gomes[13]和Jin[20]等的研究結果基本一致，芍藥素-3-半乳糖苷的含量最高，其次為矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷，與Cesonien?[7]和Oszmiański[11]等研究結果一致。

如圖2所示，峰1物質分子離子m/z 625，碎片離子m/z 463、301，是由分子離子失去一分子己糖苷[M-162]+而成，m/z 463和m/z 301之間也相差一個162的己糖苷，且m/z 301是芍藥素的配離子峰，推測峰1物質可能是帶有2 個己糖苷的芍藥素花色苷，參考相關文獻[23-24]可知峰1物質是芍藥素-3,5-二己糖苷。該種花色苷首次在蔓越莓中被檢測到。

綜合參考文獻[7,11,13,20]可知，峰2、3均為分子離子m/z 449，碎片離子m/z 287的物質，m/z 287是矢車菊素配離子峰，根據兩者出峰順序和保留時間不同分析可知，峰2物質是矢車菊-3-半乳糖苷，峰3物質是矢車菊-3-葡萄糖苷。峰4物質是母離子失去一分子阿拉伯糖[M-132]+而成，綜合保留時間分析，峰4物質是矢車菊-3-阿拉伯糖苷。峰5物質的碎片離子m/z 301是芍藥素配離子峰，是母離子失去一分子六碳糖[M-162]+而成，可知峰5物質是芍藥素-3-半乳糖苷。峰6物質的碎片離子m/z 301是芍藥素的配離子峰，是由母離子失去一個六碳糖[M-162]+而成，可知峰6物質是芍藥素-3-葡萄糖苷。峰7物質的碎片離子m/z 301是芍藥素配離子峰，是母離子失去一分子阿拉伯糖[M-132]+而成，可以確定峰7物質是芍藥素-3-阿拉伯糖。

2.3 蔓越莓花色苷抗氧化能力測定結果

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定結果

如圖3所示，蔓越莓花色苷和VC對DPPH自由基的清除能力均隨著質量濃度的增加而增強，相同質量濃度條件下，蔓越莓花色苷對DPPH自由基的清除能力強于VC，根據統計學分析，花色苷和VC的DPPH自由基清除率差異顯著（P＜0.05）。引入半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）作為一個參考指標[25]，IC50值在此定義為DPPH清除率50%時對應的花色苷或VC的質量濃度，IC50值越小，抗氧化能力越強；花色苷的IC50值為92.81 μg/mL，VC的IC50值為129.82 μg/mL，250 μg/mL花色苷和VC的清除率均在90%以上。原理為花色苷和VC可以與DPPH自由基的單電子配對，使其在517 nm波長處的吸收減弱，花色苷接受DPPH的電子數量多于VC，褪色更顯著，清除率更高，所以抗氧化能力更強。

圖3 蔓越莓花色苷的DPPH自由基清除率Fig. 3 DPPH free radical scavenging capacity of cranberry anthocyanins

2.3.2 ABTS+·清除能力測定結果

圖4 蔓越莓花色苷的ABTS＋·清除能力Fig.4 ABTS+· scavenging capacity of cranberry anthocyanins

如圖4所示，蔓越莓花色苷和VC對ABTS+·的清除能力均隨著質量濃度的增加而增強，在相同質量濃度條件下，蔓越莓花色苷對ABTS+·的清除能力強于VC，根據統計學分析，蔓越莓花色苷和VC對ABTS+·的清除能力差異顯著（P＜0.05）。ABTS在氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS+·，花色苷和VC可以抑制ABTS+·的產生，削弱其在734 nm波長處的吸收[26]。Trolox是一種VE類似物，定義Trolox抗氧化能力為1，其他物質的抗氧化能力用其相比于Trolox的倍數表示。以標準品當量質量濃度為x，吸光度為y，作標準曲線為y=-0.040 83x-0.046 69，R2=0.999 2，在250 μg/mL時蔓越莓花色苷和VC對ABTS+·清除能力分別是Trolox的2.8 倍和2 倍，蔓越莓花色苷對ABTS+·的清除能力是VC的1.4 倍。

2.3.3 總抗氧化能力測定

如圖5所示，在50～250 μg/mL范圍內，蔓越莓花色苷和VC的總抗氧化能力均隨著質量濃度的增加而增強，蔓越莓花色苷的總抗氧化能力顯著高于VC（P＜0.05），250 μg/mL蔓越莓花色苷和VC的總抗氧化能力分別為2.61、1.50 U/mL。蔓越莓花色苷的總抗氧化能力、DPPH自由基清除率和ABTS+·清除能力變化趨勢一致，質量濃度越高，抗氧化能力越強，兩者呈正相關[27-30]。

圖5 蔓越莓花色苷的總抗氧化能力Fig. 5 Total antioxidant capacity of cranberry anthocyanins

3 結 論

本實驗采用超高壓輔助提取法提取蔓越莓花色苷，提取條件為料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數60%、pH 2.0、超高壓壓力400 MPa、提取時間12 min，花色苷含量為（75.49±0.43）mg/100 g；常規溶劑提取蔓越莓花色苷，提取條件為料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數60%、pH 2.0、提取溫度40 ℃、提取時間60 min，花色苷含量為（67.31±1.08）mg/100 g；蔓越莓中總花色苷含量為（79.52±0.50）mg/100 g，超高壓輔助提取蔓越莓花色苷提取率為（94.92±0.54）%，常規溶劑提取蔓越莓花色苷提取率為（84.65±1.36）%，說明超高壓輔助提取蔓越莓花色苷的效果較好。選擇AB-8大孔樹脂對蔓越莓花色苷粗提物進行純化，凍干粉中花色苷含量從（46.10±0.92）mg/g提高到（309.26±2.37）mg/g。通過測定DPPH自由基清除率、ABTS+·清除能力、總抗氧化能力，比較蔓越莓花色苷與VC的抗氧化能力。結果表明：相同質量濃度條件下，蔓越莓花色苷的抗氧化能力強于VC。采用HPLC-MS聯用技術對蔓越莓花色苷的組成進行鑒定，共鑒定出7 種花色苷，分別為芍藥素-3,5-二己糖苷、矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-阿拉伯糖苷，其中芍藥素-3,5-二己糖苷首次在蔓越莓中被鑒定出。綜上所述，超高壓輔助提取蔓越莓花色苷效果較好，蔓越莓中花色苷含量較高，花色苷種類豐富，其抗氧化能力顯著高于VC。