基于基因測序魚露發酵橘青霉YL-1鑒定及安全性評價

宋佳佳，古汶玉，林昌浩，張曉勇，甘忠宏，謝 莉，高向陽,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 514642；2.華南農業大學海洋學院，廣東 廣州 514642）

真菌毒素是真菌代謝產生的次級天然毒性物質，主要包括黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、赭曲霉毒素、棒曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、青霉毒素等，它們幾乎能污染所有食用和飼用農產品并對人類和動物健康造成巨大威脅[1-2]。橘青霉（Penicillium citrinum）是絲狀真菌，青霉屬，能作為發酵菌株[3]。青霉能產黃曲霉毒素和青霉毒素等真菌毒素[4]，易使果蔬作物致病[5]；部分青霉亦具有很高經濟價值，如能產有機酸、制酶制劑、產青霉素等。由于青霉所具有的兩面性，其應用備受爭議。

真菌菌株YL-1是從中國潮汕傳統釀造魚露中分離的一株耐鹽、高產蛋白酶菌株[6-7]，經多方鑒定為P. citrinum，其能有效縮短魚露發酵時間，能促進魚露風味形成[8]，但P. citrinum YL-1是否能產真菌毒素鮮見報道。基因測序技術可為真菌毒素研究提供一種便捷手段，能評估預測真菌潛在的毒素代謝途徑和基因。吳榮等[9]運用基因測序技術對華根霉進行基因組測序，對基因序列進行功能注釋及代謝分析，顯示華根霉中僅存在少量聚酮合成、萜類化合物合成途徑代謝基因，并未注釋到根霉素、小孢根霉素及典型絲狀真菌毒素的合成關鍵基因，且存在大量異源物質降解途徑基因，表明華根霉基本不具備產目前已知的真菌毒素的關鍵基因或合成能力。對低滲及高滲壓條件下的茯磚茶發酵黑曲霉進行基因組測序和轉錄組測序，基因功能注釋及聯合代謝分析均未檢測到與致癌物產生有關的基因簇，從基因水平和轉錄水平驗證了茯磚茶發酵黑曲霉的安全性[10]。隨著基因測序技術的發展及完善，菌株基因測序越來越常態化，這為工業菌株的安全評價提供了一種可靠模式。

本實驗通過分析P. citrinum YL-1基因組，主要針對非核糖體多肽合成代謝（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）、聚合酮酶代謝（polyketide synthase，PKS）、PKS-NRPS聯合代謝和萜類化合物代謝、氨基酸相關代謝等涉及產真菌毒素基因和途徑進行分析[11]，從基因水平判定P. citrinum YL-1安全性，彌補傳統手段針對真菌毒素檢測存在的缺陷。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

菌株YL-1由中國著名汕頭魚露廠所產魚露發酵液中分離[6]。

硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、氯化鉀、硫酸亞鐵（均為分析純） 廣州精科儀器試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖、Gold View染液、冰醋酸、乙二胺四乙酸 廣州生工生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Ba600mot普通生物學顯微鏡 廣州匯騰科學儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀美國Bio-Rad公司；YA28X-4T/10高壓滅菌鍋 上海江霞閥門成套設備有限公司；SW-CJ-1G型單人凈化工作臺廣州瑞智設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株YL-1培養及形態學觀察

察式培養基配制參考Xiao Yunzhu[6]、Xie Li[8]等方法，10%鹽度察式液體培養基在原基礎加入對應濃度氯化鈉。菌株YL-1經10%鹽度察式培養基培養24 h后，菌體挑于顯微鏡下壓片觀察。

1.3.2 菌株YL-1分子生物學鑒定

參照ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM試劑盒提取菌株YL-1 DNA，依據霉菌通用ITS1/ITS4引物擴增YL-1菌株ITS基因序列。反應體系共25 μL，包含Premix Taq 12.5 μL，ITS1及ITS4各1 μL，YL-1菌株DNA 1 μL，無菌水9.5 μL。95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 次循環，72 ℃延伸10 min。在凝膠成像系統中觀察擴增產物凝膠電泳結果，并切取合適條帶進行純化，并送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序[6]。

依據BLAST軟件及GenBank數據庫比對測定菌株的ITS基因序列，在NCBI數據庫中進行分析，選取1 株雅致放射毛霉菌株（Actinomucor elegans strain QH23）及3 株霉菌模式種的ITS基因序列作為外群，采用MEGA 5.05軟件分析菌株YL-1系統發育，依據Neighbor-Joining法構建菌株YL-1的系統發育樹[6]。

1.3.3 菌株YL-1保藏

菌株YL-1鑒定為P. citrinum，經廣東省微生物研究中心再次鑒定后保藏。

1.3.4 菌株P. citrinum YL-1樣品制備及測序

10%鹽度察式液體培養基培養菌株YL-1，菌液12 000 r/min離心10 min，獲得P. citrinum YL-1菌體，-80 ℃保藏送樣測序，菌株基因組survey測序由廣州美吉生物科技有限公司完成。

1.3.5 P. citrinum YL-1基因組掃描測序數據

P. citrinum YL-1委托廣州美吉生物科技有限公司應用Illumina平臺HiSeq測序技術進行基因組survey測序，原始圖像數據經過Base Calling轉化為序列數據，對序列數據進行堿基質控及數據質量剪切及評估。運用SOAPdenovoV2.04組裝軟件對優化序列進行拼接，再利用GapCloser v1.12軟件對組裝結果進行堿基校正及局部內洞填充。對獲取的優化序列進行包括rRNA/tRNA查找、重復序列篩選等生物信息分析；其他匹配基因相關信息獲取來自網絡數據庫公布數據（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.3.6 P. citrinum YL-1 survey測序基因預測與注釋

利用GeneMark軟件與Augustus軟件分析優化序列，評估預測編碼區及基因，得到基因序列信息后上傳至NR、GO、Genes、String等數據庫并進行比對，從而獲得預測基因的注釋信息。

1.3.7 基因組比較

依據MUMmer工具包中Mummer程序比對P. citrinum YL-1基因組與其他典型的產真菌毒素菌的菌株的基因組信息，評估P. citrinum YL-1基因組產真菌毒素性能。

1.4 數據分析

數據采用SPSS 12.0進行初步處理；基因進化樹采用MEGA N-J法構建，其他圖像采用Origin Pro 8.5、Adobe_Photo shop_CS5及Vision 2003處理。

2 結果與分析

2.1 YL-1菌株形態學觀察結果

如圖1所示，在顯微鏡下觀察菌株YL-1形態學特征，發現分生孢子鏈為明顯的分散柱狀，大多分生孢子梗從基質生出，梗壁平滑，少量從氣生菌絲生出，且長度較小；孢子近球形，大小2.5～3.2 μm，孢子壁圓滑；呈帚狀枝單輪生或雙輪生；每輪?；?～5 個，大小為8.0～16×2.5～3.0 μm，頂端膨大，囊狀；中部瓶狀，梗頸短，大小為8.0～9.0×2.0～2.5 μm。在形態學上與青霉屬菌株相近。

2.2 YL-1菌株ITS基因序列的PCR擴增

1%瓊脂糖凝膠電泳顯示YL-1菌株ITS基因序列PCR擴增的DNA長度在500～750 bp之間，條帶清晰，亮度高。達到常規ITS基因序列鑒定要求。如圖2所示，經測定，其DNA長度為bp。

圖2 菌株YL-1的ITS擴增序列電泳圖Fig. 2 PCR amplification of the ITS sequence of strain YL-1

2.3 菌株YL-1鑒定及構建系統發育樹

圖3 基于ITS基因序列相似性構建菌株YL-1系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed for strain YL-1 based on ITS gene sequence similarity

依據BLAST軟件與GenBank數據庫中的已知模式霉菌序列對菌株YL-1的ITS序列進行同源性比對，結果表明，菌株YL-1與Penicillium同源性極高。構建進化樹如圖3所示，菌株YL-1與P. citrinum處于同一分支上，且同源性高達99%，因此確定菌株YL-1為P. citrinum（P. citrinum YL-1，NCBI登錄號：KF544957）。

2.4 菌株YL-1保藏

菌株YL-1交由廣東省微生物菌株保藏中心再次鑒定為P. citrinum，鑒定結果與本實驗室鑒定結果一致；并對菌株進行保藏，保藏號GDMC60027，保藏方式為-80 ℃真空冷凍凍干。

2.5 P. citrinum YL-1基因組序列特性及分析

2.5.1 P. citrinum YL-1基因組測序拼接與注釋

P. citrinum YL-1測序結果表明其基因組大小在31.92 Mb左右，大小適中，GC含量為46.27%，屬于常規真菌GC含量范圍。對基因數據進行質量分析發現1 000 bp以上基因組覆蓋率為99.51%。對測序后拼接片段進行基因預測與編碼區分析，共預測得編碼基因11 980 個，平均基因長度為1 349 bp。預測基因序列轉換成蛋白序列與多個數據庫NR、KEGG、COG/KOG、Genes、GO及String進行比對，獲得相應功能注釋信息，最終被KOG注釋基因5 417 個，被COG注釋基因4 946 個，未被KOG/COG注釋1 289 個，KOG/COG注釋率高達86.5%，表明編碼基因質量良好；被KEGG注釋基因3 525 個（表1）。P. citrinum YL-1基因組序列原始數據NCBI登陸號：SRR6322469。

表1 組裝及注釋結果統計Table 1 Genomic assembly and annotation statistics

2.5.2 P. citrinum YL-1基因功能KOGs分類

對菌株進行KOGs基因注釋與功能分類可進一步揭示菌株的生理代謝過程。P. citrinum YL-1基因功能可分為24 個功能組，如圖4所示，其中約13.38%預測為常規的功能基因分組；涉及分子功能的也較多，包括基因復制、轉錄、修復、翻譯、重組和核糖體結構和生物合成、翻譯后修飾及信號傳導機制，蛋白翻轉和分子伴侶、碳水化合物轉運與代謝及氨基酸運輸與代謝等，在250～400之間；而針對細胞保護、胞外結構及核結構注釋的基因較少，幾乎沒有注釋到細胞修飾相關的基因；約7.65%的預測基因由于蛋白質功能不能確定，匹配性較差，所具備的生理功能尚不清楚，未能有良好匹配結果。而在次級代謝中，存在較多的降解途徑，主要涉及對芳香族類化合物、萜烯類化合物等，這與魚露發酵中豐富的風味物質形成可能相關，魚露在發酵初期優勢菌經分泌各種酶（主要為蛋白酶）水解魚體生成多種氨基酸、糖類，這些物質通過一系列的變化進一步形成醛類、酮類、芳香族類及萜烯類化合物，構成魚露發酵后期特殊的色澤、香氣，并最終賦予魚露特征滋味[12]；同時KOGs注釋也匹配到一些與藥物代謝的途徑，可能與青霉屬菌株具有產青霉素等同源性基因相關[13]。

圖4 P. citrinumYL-1預測基因KOGs分類Fig. 4 KOGs functional classi fi cation of predicted genes of P. citrinum YL-1

2.6 P. citrinum YL-1產真菌毒素相關代謝途徑分析

據報道，已有400多種真菌毒素相繼被發現，其中包含霉菌毒素300多種。對這些真菌毒素的產生途徑分析可知，大多毒素形成都需要通過PKS、NRPS等四大途徑及關鍵基因調控，極少部分通過氨基酸代謝等途徑產生[9]。基于P. citrinum YL-1基因組分析與基因注釋結果，分析涉及到的途徑及關鍵基因，可以從基因水平上評估P. citrinum合成真菌毒素的潛在可能性及產真菌毒素的能力。

2.6.1 非核糖體多肽類與聚酮代謝

大多數真菌毒素合成中的關鍵代謝途徑是非核糖體多肽類與聚酮代謝及混合代謝。在青霉屬中，多數真菌毒素也是由這些代謝途徑產生前體物質，再經過催化和后期修飾合成，典型的如黃曲霉毒素[14]、青霉素[15]等真菌毒素的前體物質。另外在曲霉中也有報道PKS-NRPS是環匹阿尼酸生物合成的關鍵途徑[16]；紅曲霉被運用于我國傳統釀造工業中，研究發現少量紅曲霉也能產生毒素，并大多通過PKS途徑進行合成[17]。同樣在青霉中發現的大多數真菌毒素也主要是通過NRPS途徑、PKS途徑調控合成。如表2所示，僅注釋到一種能合成黃曲霉毒素的基因簇基因Alfd（去氧松酸酮還原酶）及其他5 種相關基因：乙酰輔酶A羧化酶基因Acac、葡萄球菌8-O-甲基轉移酶基因Mota 2 個、去甲基海馬膽囊素6-O-甲基轉移酶基因Motb 2 個（KO：00254）。在黃曲霉合成基因簇的基因中，pksL、Alfc、pksA為合成關鍵基因，LaeA為全局調控因子，在轉錄水平上的調節至關重要；而Af l R和Af l r這2 個基因對黃曲霉毒素合成基因簇中的特異性轉錄因子起到了十分重要的作用，除Af l J外其他基因均受到Af l R基因的調控[18]。雖注釋到一種能合成黃曲霉毒素的基因簇同源基因Alfd，但其他黃曲霉合成基因簇同源基因并未注釋，特別是調控基因LaeA及aflR基因等；且Alfd基因主導的黃曲霉毒素代謝途徑尚不完整，缺乏關鍵的基因Pksa、Alfc、pksA，注釋到的黃曲霉毒素合成基因Alfd同源性僅為81%，相似性不高。因此以目前的數據不認為P. citrinum YL-1在魚露發酵過程中存在產真菌毒素的PKS途徑。

表2 注釋涉及產真菌毒素四大途徑及其他代謝Table 2 Annotation of the 4 key biosynthetic pathways and related genes as well as other metabolites

對于NRPS途徑，僅注釋到微囊藻毒素合成途徑中的一種天冬氨酸消旋酶McyF相關基因（KO：01054），表明P. citrinum YL-1基本不存在產生真菌毒素的NRPS途徑。PKS-NRPS聯合代謝途徑一般存在于共生菌中，如小孢根霉素及根霉素是由根霉Rhizopus microsporus內共生菌Burkholderia屬菌所產生，在根霉屬（Rhizopus spp.），有存在內共生細菌的報道[19]，也有報道提及Aspergillus也可能作為紅曲霉的內生菌[20]，但目前在P. citrinum相關研究中鮮見報道。

圖5 17-mer雜合率評估Fig. 5 Evaluation of 17 mer hybrid rate

圖6 P. citrinumYL-1測序深度與GC含量相關性分析（以10 000 bp為標準）Fig. 6 Correlation analysis between sequencing depth and GC content of P. citrinum YL-1 (Standardized by 10 000 bp)

對P. citrinum YL-1菌株雜合率、測序深度與GC含量關聯分析來考察P. citrinum YL-1測序序列信息的質量情況，來判斷在P. citrinum YL-1基因組測序數據中是否存在其他菌種（內共生菌）基因序列。對菌株雜合率進行分析，運用K-mer頻率分布統計確定，如圖5所示。P. citrinum YL-1的雜合率遠低于0.1%，雜合率低。這一結果和送樣菌株檢測與P. citrinum同源性極高的結果相吻合。由圖6可知，GC含量和覆蓋率數據相對集中，不成分散狀態，GC含量在44%～56%之間。雜合率、測序深度與GC含量關聯分析表明P. citrinum YL-1菌株不存在共生菌。吳榮等[9]在華根霉全基因組數據時，通過雜合率分析排除了華根霉產共生菌的可能性，也是基于此種分析。在基因注釋結果中，也未發現PKS-NRPS混合代謝途徑，表明P. citrinum YL-1不存在PKS-NRPS混合代謝合成途徑。

2.6.2 萜類化合物代謝途徑

真菌毒素也可能由萜類化合物代謝產生，如典型的單端孢霉烯族毒素，此類毒素主要是由Fusarium、Stachybotrys和Myrothecium等真菌屬產生[21-23]。目前已有200多種單端孢霉烯族毒素被報道。它的合成機理是先經過萜類化合物代謝生成前體物質，再經法尼基焦磷酸環化為萜類物質，在這一過程中乙酰轉移酶和多個C15細胞色素P450單加氧酶起到關鍵調控作用，并有轉運蛋白參與合成[21]。但并不是所有的萜類物質都均有毒性，相反還具有一定的生理活性，如名貴中草藥靈芝三萜[24]、角鯊烯[25]等對人類許多疾病的預防和治療有顯著療效。

P. citrinum YL-1基因組次級代謝部分KEGG注釋（圖4），P. citrinum YL-1基因組有40 個基因注釋到萜類化合物代謝中（KO：0013、00900、00909、00904），包括15 個有關萜類化合物降解的基因，他們主要分布在輔酶Q和其他萜類-醌類化合物代謝途徑中，參與生育酚、質醌等物質的合成；在萜類物質合成骨架結構注釋到20 個基因，三萜和倍半萜合成途徑注釋到4 個基因，二萜化合物合成途徑僅注釋到1 個基因（表2），這些結果表明P. citrinum YL-1有合成萜類物質的潛在可能性，但并不意味能合成真菌毒素。代謝通路關聯分析表明，戊磷酸代謝后產物能間接作用于輔酶Q和其他類萜醌合成，并進入倍半類萜和三萜化合物代謝途徑，參與角鯊烯三萜化合物的合成；而對于二萜合成途徑，僅注釋到一個赤霉素雙氧酶基因，二萜化合物的合成不成完整途徑，赤霉素雙氧酶也不屬于真菌毒素物質合成關鍵酶[26]，故此注釋途徑無法形成產生真菌毒素相關的通路。綜上表明P. citrinum YL-1不存在合成毒性萜類化合物的途徑，反而注釋到角鯊烯合成的完整途徑，這為P. citrinum YL-1的研究及綜合開發利用提供一個良好的契機。作為中國傳統魚露發酵中的重要產酶菌株，經過長時間的微生物菌群演變，P. citrinum YL-1能在高鹽環境中脫穎而出，可見其具有多方面的應用價值。

2.6.3 其他次級代謝途徑

P. citrinum YL-1還存在其他大量次級代謝途徑（圖4），其中注釋到的部分細胞色素P450不僅是萜類化合物代謝的關鍵酶，許多還是藥物代謝、異源物質代謝等藥物代謝過程中的關鍵酶[21]。相對來說，P. citrinum YL-1個別的基因與酶注釋到青霉素、鏈霉素、新生霉素等抗生素合成途徑，但并沒有完整的代謝通路（KO：00521、00401、00311），暗示P. citrinum YL-1可能存在合成青霉素、鏈霉素、新生霉素等抗生素的潛在性（表2）。這與P. citrinum YL-1存在于魚露發酵生產，在長時間多菌相發酵中能強勢生長的情況存在關聯，高鹽及P. citrinum菌株可能分泌的抗生素對其他微生物有抑制作用，而P. citrinum本身對鹽度有高度的耐受性[6]。除了以上四大途徑，部分真菌毒素還能由氨基酸合成或協助合成，但注釋到的氨基酸代謝途徑僅參與了質醌、生育酚、維生素等物質的合成，這與測序基因組中RNA查找的某些轉運氨基酸個數的多少可能存在一定聯系，如圖7所示；注釋途徑關聯分析中并沒有發現氨基酸代謝流向真菌毒素產生途徑的趨勢，表明P. citrinum YL-1存在氨基酸代謝產生真菌毒素的可能性極小。由目前報道可知，雖可能還存在真菌毒素產生的其他途徑，但幾乎均由上述幾大類代謝途徑單個或多個協同作用產生，如在對Aspergillus ustus和A. terreus研究中發現聚酮代謝同萜類化合物代謝混合作用能產生Austin[27]與Austinol[28]?；谝陨戏治霰砻鳎赑. citrinum YL-1中，僅注釋到黃曲霉毒素的合成途徑，但其合成途徑并不完整，并不存在其他典型真菌毒素合成的完整代謝途徑，相反注釋到的藥物代謝途徑可能對部分毒素還存在降解能力，但并不能完全排除P. citrinum YL-1產真菌毒素的可能性。

圖7 P. citrinumYL-1注釋tRNA氨基酸種類統計圖Fig. 7 The types and amounts of tRNA amino acids annotated in P. citrinum YL-1

3 討 論

魚露在我國食用歷史悠久，其味道滋潤鮮美，香氣宜人，且營養價值高，富含各種必需氨基酸、多種有機酸和微量元素，并且還富含牛磺酸，因此廣受人們喜愛。菌株YL-1是從魚露發酵液中分離出的一株真菌，具有耐鹽及高產蛋白酶的特性，本研究對菌株YL-1進行生物學及分子學鑒定其為P. citrinum，與實驗室前期研究結果高度一致[6]。利用菌株基因組survey測序信息從基因水平上分析P. citrinum YL-1產毒素的潛在能力，相對驗證了該菌株的安全性，與傳統菌株毒理性的研究相比，其簡單便捷。全基因survey測序顯示P. citrinum YL-1基因組大小為31.92 Mb，與大多數真菌的基因含量相吻合；GC含量為46.27%，屬于常規物種的水準，表明測序結果良好。初步注釋基因11 980 個，主要注釋基因分布在糖酵解、氨基酸代謝及碳水化合物轉運與代謝等途徑，其次在核糖體結構和生物合成、翻譯后修飾、信號傳導機制等途徑也存在大量注釋基因，另外在分子伴侶和蛋白翻轉、氨基酸運輸與代謝等也存在較多注釋基因，注釋基因功能覆蓋面較為全面，能良好代表P. citrinum YL-1實際生物信息。通過基因注釋信息與特異序列比對可知，在P. citrinum YL-1中，不存在目前已報道的青霉毒素和其他典型真菌毒素關鍵代謝途徑；可能存在1 種產黃曲霉毒素的同源性基因Afld及其他5 種相關基因，但并未注釋到其完整通路，顯示P. citrinum YL-1在基因水平上幾乎不產真菌毒素，與吳榮等[9]基于基因組測序數據對華根霉產真菌毒素進行分析的方法及結果相似。在對魚露發酵不同時期的菌相做分析時，也發現有黃曲霉的存在，因此，對魚露中是否含有黃曲霉毒素以及它的合成代謝來源還應做進一步分析。

由于仍有很多真菌毒性物質的產生途徑及基因沒有被挖掘和分析，或者仍有一些毒素的產生機理并不屬于以上四大途徑，亦或未在各數據庫中公布，所以并不能完全排除P. citrinum YL-1不產真菌毒素的可能性?？山Y合當前動物實驗、儀器檢測[29]或探針免疫技術[30]等其他技術對P. citrinum YL-1安全性進行綜合性評價。在對P. citrinum YL-1溶血性實驗中，以洛克福青霉P. roqueforti NL-1為陰性對照，結果顯示P. citrinum YL-1作用小鼠血液后沒有出現溶血現象，表明P. citrinum YL-1對小鼠紅細胞沒有毒害作用，這與從基因水平上分析P. citrinum YL-1不產毒素的結果相吻合，在現有的數據上進一步佐證了P. citrinum YL-1運用于魚露及相關產品的發酵相對是安全的，但也不能絕對排除P. citrinum YL-1不產毒素的特性，P. citrinum YL-1應用于魚露發酵的安全性仍值得進一步關注考察。