加壓毛細管電色譜法分離檢測薯片中丙烯酰胺的含量

馮 軍，肖曉茹，李利軍2,,*，程 昊2,，黃文藝2,，李彥青2,，孔紅星2,

（1.廣西科技大學醫學院，廣西 柳州 545005；2.廣西科技大學 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；3.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006）

2002年瑞典國家食品局報道了熱加工食品中產生比飲用水中含量高500多倍的丙烯酰胺，隨即引起了全球的廣泛關注[1]。含淀粉類食品在高溫加熱過程中易產生高含量的丙烯酰胺[2-3]。研究發現，丙烯酰胺具有遺傳毒性、神經毒性，可誘發動物機體癌變，是一種具有潛在致癌性的物質[4-5]。1994年國際癌癥機構就將丙烯酰胺列為人類潛在致癌物[6]，因此對食品中丙烯酰胺的含量控制具有十分重要的意義。

目前用于食品中丙烯酰胺的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳技術等[7-13]。氣相色譜-質譜法和液相色譜-質譜法靈敏度和準確度雖然較高，但一般需要衍生，操作繁瑣，對設備要求很高。而高效液相色譜法雖最為常用，但由于食品基體復雜，樣品預處理一般采用固相萃取法，以避免雜質干擾。這使得樣品預處理步驟繁瑣、復雜，成本較高、分析周期長。Zhou Xun等[13]采用膠束毛細管電泳對薯片中的丙烯酰胺進行了分離測定。該方法雖然避免了固相萃取的樣品預處理，但由于在電泳緩沖溶液中加入了十二烷基硫酸鈉作為準固定相以實現電泳分離，導致了其精密度不高、重現性略差。

與上述方法相比較，加壓毛細管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）法具有高效液相色譜與毛細管電泳的雙重分離機理，兼具兩者的優勢，根據待測物質分配系數不同以及電泳淌度的差異，對樣品進行快速高效分離，具有選擇性好、柱效高、分離快速等優點[14]。因此，pCEC尤其適于基體復雜、難于分離的多組分樣品的分離測定。目前，pCEC已廣泛應用于環境分析[15]、食品安全檢測[16-20]、生物檢測[21-22]、藥物分析及中藥分析[23-29]等研究領域。

本實驗以薯片中微量丙烯酰胺為研究對象，將pCEC技術應用于油炸薯片中丙烯酰胺的含量測定，在流動相為乙腈-15 mmol/L NaH2PO4（pH 4.7）緩沖鹽溶液（15∶85，V/V）、流速0.04 mL/min、分離電壓-2 kV、紫外檢測波長202 nm的條件下，薯片中的丙烯酰胺與干擾物質分離良好、結果準確，克服了常規檢測方法存在的不足之處，同時拓展了pCEC法在食品安全檢驗中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺對照品（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技有限公司；4 種不同品牌的薯片樣品 柳州市萬達商業廣場超市；磷酸二氫鈉（分析純） 廣東光華科技有限公司；正己烷、乙醇（均為分析純） 成都市科農化工試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；實驗用水為二次蒸餾水。所用的試劑和溶液在進入pCEC儀之前用0.22 μm微孔濾膜過濾，超聲除氣。

1.2 儀器與設備

TriSepTM-2100 pCEC 上海通微分析技術有限公司；HW-2000色譜工作站 上海千譜軟件有限公司；SZ-93型自動雙重水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；DL-60D型80 W超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；Avanti J-HC型高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；PHS-25CW型實驗室pH計 上海般特儀器有限公司；XW-80A型渦旋混合器 上海精科實業有限公司；0.22 μm尼龍66針式過濾器 天津市津騰實驗設備有限公司；SHZ-D（III）循環水式真空泵 上海錦賦實驗儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照溶液配制

稱取0.008 0 g丙烯酰胺對照品于棕色容量瓶中，用二次蒸餾水溶解并稀釋至100 mL，配制成80 μg/mL的對照品儲備液，作為100%對照品工作液，用0.22 μm濾膜過濾，置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.2 薯片樣品預處理

分別取市場上4 種不同品牌的薯片適量，研磨成粉。準確稱取3.00 g（精確到0.01 g）已研磨的各種薯片樣品分別置于50 mL的具塞離心管中，加入20 mL水和少量正己烷除酯，超聲溶解30 min，置于高速冷凍離心機中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，吸取下層水相5 mL，于離心機0 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上層清液3 mL，用0.22 μm濾膜過濾，放置冰箱中4 ℃避光保存。

1.3.3 pCEC條件的優化

色譜柱選用C18毛細管填充柱，柱子總長為45 cm，有效長度為20 cm，內徑為100 μm，ODS填料3 μm；流動相：比較有機溶劑種類（甲醇、乙腈）、有機溶劑體積分數（10%、15%、20%）、NaH2PO4緩沖鹽溶液濃度（10、15、20 mmol/L）及pH值（4.0、4.7、6.0、7.0）、分離電壓（6、4、2、0、-2、-4 kV）各條件下對薯片樣品中丙烯酰胺保留時間和分離度的影響；檢測波長：對丙烯酰胺對照品溶液進行全波長掃描（190～400 nm），確定樣品的檢測波長；進樣量40 μL，分流閥壓力4.5 MPa；電壓施加在毛細管的出口端，進口端接地。

1.3.4 pCEC分析方法學驗證

1.3.4.1 線性關系與檢出限

取不同體積（0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0 mL）的1.3.1節對照溶液配制的丙烯酰胺100%對照品工作液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，渦旋振蕩搖勻，配制成體積分數分別為2.5%、5%、10%、20%、25%、40%系列對照品工作液，分別進行pCEC分析。計算丙烯酰胺的線性范圍、回歸方程及相關系數，并以3 倍信噪比對應的質量濃度確定丙烯酰胺的檢出限。

1.3.4.2 精密度

同一天內連續6 次對同一丙烯酰胺標樣進行pCEC分析，測定丙烯酰胺的保留時間和峰面積，計算精密度（以相對標準偏差表示）。

1.3.4.3 樣品分析及含量測定

采用實驗建立的分析方法，對已處理好的4 種不同品牌薯片樣品溶液進行分析檢測，每個樣品平行測定3 次。

1.3.4.4 加標回收率

取上述等體積的薯片樣品溶液3 份，分別添加體積分數5%、10%、20%低、中、高3 個水平的對照品溶液，進行pCEC分析，計算丙烯酰胺的加標回收率。

1.4 數據分析

數據采用OriginLab軟件包中Originpro 8程序進行處理。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的確定結果

2.1.1 檢測波長

用紫外分光光度計對丙烯酰胺在190～400 nm波長之間進行掃描，丙烯酰胺在202 nm波長處有最大吸收，因此選擇202 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相中有機溶劑的選擇及優化結果

2.1.2.1 有機溶劑種類比較

圖1 甲醇（a）和乙腈（b）對樣品分離情況的影響Fig. 1 Effects of methanol (a) and acetonitrile (b) on separation of samples

由圖1可知，甲醇作有機流動相時，待測物質峰存在雜質峰干擾，分析周期較長；而乙腈作有機流動相時，待測物質樣品峰形尖銳，與相鄰雜質峰之間能夠得到完全分離，而且分析周期較短，因此選擇乙腈作為流動相的有機相。

2.1.2.2 有機溶劑體積分數優化

由圖2可知，隨著乙腈體積分數的增大，樣品中各組分保留時間縮短，這是因為乙腈比例增加，流動相黏度下降，電滲流增大，同時由于有機溶劑比例增加，洗脫能力增大，樣品組分更容易被洗脫，因而保留時間縮短。當乙腈體積分數為10%時，樣品中丙烯酰胺峰與雜質峰未完全分離；20%乙腈時，分析時間明顯縮短，但丙烯酰胺峰與雜質峰基本重疊；15%乙腈時，雜質峰和丙烯酰胺峰分離良好，分析時間適中，所以選擇15%乙腈作為最優體積分數。

圖2 流動相中乙腈體積分數對分離效果的影響Fig. 2 Effect of mobile phases containing different percentages of acetonitrile on separation efficiency

2.1.3 緩沖鹽

pCEC系統中，為了能夠形成穩定的電場和電滲流，需要在流動相中加入可以電離的酸堿或者緩沖鹽溶液[15]，緩沖鹽溶液濃度決定了Zeta電位、雙電層厚度和毛細管內壁表面電荷超量等。由圖3可知，NaH2PO4緩沖鹽溶液濃度為10 mmol/L時，丙烯酰胺峰柱效較低，雜質峰對丙烯酰胺峰存在一定的干擾，15 mmol/L時，丙烯酰胺峰與雜質峰之間的分離度良好，可達到基線分離。濃度為20 mmol/L時，由于電泳中高焦耳熱的影響，待測丙烯酰胺峰增寬嚴重，柱效下降，以致于與相鄰雜質峰重疊，無法得到很好地分離。實驗選擇15 mmol/L緩沖鹽溶液為最優離子強度。

圖3 緩沖鹽濃度對分離效果的影響Fig. 3 Effect of buffer salt concentration on separation ef fi ciency

2.1.4 緩沖溶液pH值

從圖4可以看出，隨pH值升高，丙烯酰胺保留時間稍有縮短，但影響并不十分明顯。而pH值對分離度的影響卻非常關鍵，如圖4所示，pH 4.0與pH 4.7時，樣品電泳譜圖未見明顯變化，隨著pH值升高，樣品中丙烯酰胺與相鄰雜質峰分離度逐步降低，當pH 7.0時，丙烯酰胺與雜質峰完全重疊，無法分離，所以選擇不調節pH值（pH 4.7）為緩沖體系的最佳pH值。

圖4 緩沖溶液pH值對分離效果的影響Fig. 4 Effect of buffer salt pH values on separation

2.1.5 分離電壓

圖5 分離電壓對樣品中丙烯酰胺分離效果的影響Fig. 5 Effect of separation voltage on separation efficiency

在實驗中，毛細管入口是接地極的，正負極都施加在毛細管出口端。由圖5a～c可知，正電壓（6、4、2 kV）時，隨著電壓增大，丙烯酰胺出峰時間稍有延后，但未見明顯變化，這是因為當在毛細管出口端施加正電壓時，電滲流方向則朝著毛細管入口端，電滲流方向與壓力流方向相反，隨著分離電壓的增大，電滲流也隨之變大，丙烯酰胺受到的電場力也增大，電滲流作用力與壓力流和電場力相互作用，使得丙烯酰胺的電泳表觀淌度減小，出峰時間稍有延長。0 kV情況下，丙烯酰胺與雜質峰重疊（圖5d）。

由圖5e～f可知，負電壓（-2、-4 kV）時，隨著電壓絕對值增大，丙烯酰胺出峰時間明顯縮短，靈敏度提高，分離度有所降低，-2 kV時，丙烯酰胺與相鄰雜質峰之間可得到基線分離。這是因為當在毛細管出口端施加負電壓，電滲流方向朝向毛細管出口端，隨著分離電壓的不斷增大，電滲流方向與壓力流方向一致且逐步增大，丙烯酰胺在泵壓力、電滲流和方向相反電場力的相互作用下，整體分析速度提高。綜合考慮出峰時間，分離度和靈敏度，選擇-2 kV作為樣品的最優分離電壓。

2.2 線性關系與檢出限結果

將不同質量濃度的丙烯酰胺對照品溶液分別進樣，采用pCEC進行分析，同一質量濃度重復進樣3 次。取3 次平均峰面積（Y），對標準品質量濃度（X，μg/mL）進行線性回歸。丙烯酰胺在2～32 μg/mL范圍內線性關系良好，線性方程為Y=758.44X-130.84（r=0.999 4）。以3 倍信噪比為標準計算丙烯酰胺的檢出限為0.30 μg/mL。

2.3 精密度實驗結果

取上述配制好的體積分數為40%丙烯酰胺對照品溶液，在最優色譜條件下進樣，重復進樣6 次。丙烯酰胺峰面積的相對標準偏差為2.84%，表明該方法具有良好的精密度。

2.4 樣品分析及含量的測定結果

經過條件優化后獲得了最優pCEC分析條件：以C18色譜柱（柱長為45 cm，有效長度為20 cm，內徑為100 μm）進行分離，流動相：乙腈-15 mmol/L NaH2PO4緩沖鹽溶液（pH 4.7）（15∶85，V/V）；流動相流速為0.04 mL/min；分離電壓為-2 kV；檢測波長為202 nm。

采用優化后的分析方法獲得的市場上4 種不同品牌的薯片樣品以及丙烯酰胺標樣的分析結果見圖6和表1。薯片中丙烯酰胺的平均含量范圍為1.867～4.232 μg/g。不同品牌薯片中丙烯酰胺含量略有差異，結果與文獻[30]報道一致。

圖6 丙烯酰胺樣品的pCEC譜圖Fig. 6 pCEC chromatograms of acrylamide standard, spiked potato chips, and commercial potato chips samples

表1 薯片中丙烯酰胺的含量（n=3）Table 1 Content of acrylamide in potato chips (n= 3)

2.5 加標回收率結果

按1.3.4.4節進行加標回收實驗。丙烯酰胺在低、中、高的回收率分別為104.0%、95.3%、108.1%，相對標準偏差分別為0.93%、1.48%、1.36%，說明該方法準確度較高。

3 結 論

本實驗建立了pCEC法檢測食品中丙烯酰胺含量的新方法，通過對薯片樣品中丙烯酰胺含量的檢測，驗證了該方法的可行性，為丙烯酰胺的分離測定提供了新的方法。丙烯酰胺實現了快速高效地分離，樣品加標回收率為95.3%～108.1%，相對標準偏差均低于1.48%，檢測限達到0.30 μg/mL。與高效液相色譜法相比，該方法簡便易行，省略了固相萃取，簡化樣品預處理操作步驟；與膠束毛細管電泳方法[13]相比，低于膠束毛細管電泳相對標準偏差為2.61%～9.65%，精密度較好；這說明方法操作簡單、快速高效、精密度高、檢測限低，能夠很好地對薯片中的微量丙烯酰胺進行分離測定，可對食品薯片的安全檢測具有一定的借鑒和啟發作用。