自然發酵豆醬中明串珠菌的分離鑒定

張 平，張鵬飛，劉斯琪，岳媛媛，烏日娜*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

發酵食品是在一系列微生物共同作用下發酵而成的食品，通過發酵不僅可以保存易腐食品，而且可以改善食品的生物利用性[1]。傳統發酵食品中微生物的復雜性是有目共睹的，其中的微生物資源亟待人們開發利用。豆醬又名黃豆醬、黃醬或大豆醬，在我國東北地區也被稱為大醬，是一種營養豐富、香氣馥郁的傳統發酵大豆食品[2-3]。豆醬不僅美味可口，還含有豐富的生物活性物質使其具有良好的保健功能，研究表明，豆醬具有抗癌[4]、有助于肝臟解毒、促進自然殺傷細胞的復活、抑制腫瘤[5]、預防高血壓和降血壓[6]、控制肥胖[7]、增強免疫功能、改善和預防過敏[8]、抑制膽固醇吸收、除卻放射性物質、防止胃潰瘍、抗氧化等功能[9]。在豆醬的自然發酵過程中，乳酸菌是與豆醬風味息息相關的細菌，它能夠利用大豆中的蛋白質、脂肪、碳水化合物等，分解成為小分子的醛、酸、酯等風味物質，使豆醬的pH值和各種養分發生變化[10-11]。

明串珠菌是一種G+C含量低于50%的異型發酵乳酸菌，兼性厭氧，菌落為圓形，直徑小于1.0 mm，呈灰白色，光滑濕潤，中心凸起但邊緣整齊，透明度較低[12]，其大小約為0.7 μm×1.2 μm，在電鏡下通常為橢圓形或球形，以成對或短鏈形態排列，極少為長鏈，革蘭氏染色呈陽性。明串珠菌屬于化能有機營養型，在兼性厭氧環境中生長情況最佳，即0.05 g/100 mL cysteine·HCl、19.8% CO2、11.4% H2和N2。其生長要求培養基內包含復雜的生長素和氨基酸。屬內所有種的生長均離不開煙酸、硫胺素、泛酸、生物素，但都不需要鈷胺素和對氨基苯甲酸。明串珠菌能夠以碳水化合物為發酵底物來維持生長，同時伴隨產生D-乳酸、乙酸、細菌素、胞外多糖、甘露醇、雙乙酰等代謝產物[13-16]，而明串珠菌的這些特性使其在醫藥衛生、食品保健等領域的發展擁有廣闊前景。

明串珠菌的生存環境十分廣泛[17-18]，植物表面和根部較為常見。據報道明串珠菌是豆醬發酵初期的優勢菌，對豆醬的啟動發酵起到了重要的作用[19]。明串珠菌能夠在發酵制品中代謝產生葡聚糖、甘露醇等多種功能化合物，可用于生產代血漿、保健性食品甜味劑、選擇性刺激腸道內有益微生物的生長繁殖；也可代謝產生雙乙酰等多種風味物質，影響發酵制品的風味[20]；還可代謝生成細菌素，對一些常見致病菌等有抑制作用[21]，能夠用作新型食品防腐劑和飼料添加劑，除此之外明串珠菌還能產酸[22]、代謝生成K族維生素等。因此，明串珠菌在食品、醫療等領域一直受到人們的關注。然而，目前對豆醬中明串珠菌的研究鮮有深入報道。

因此，本實驗旨在從傳統自然發酵豆醬中分離明串珠菌，并對菌株的益生特性進行篩選，以期篩選出益生性優良的明串珠菌菌株，并為明串珠菌進一步研究、開發、保護以及在工業化生產方面的應用提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

采自東北6 個地區（遼寧省沈陽市沈河區、遼寧省沈陽市遼中區、遼寧省沈陽市新民市、遼寧省丹東市、遼寧省阜新市、吉林省四平市）的傳統自然發酵豆醬，共計56 份豆醬樣品。包括沈陽3 份樣品、遼中9 份樣品、新民12 份樣品、丹東12 份樣品、阜新10 份樣品、四平10 份樣品。

1.1.2 試劑

10×TE緩沖液、1 mol/L Tris-HCl Buffer、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，pH 8.0）、10%十二烷基硫酸鈉溶液（sodium dodecyl sulfate，SDS）、20 mg/mL蛋白酶K、10 mol/L十六烷基三甲基溴化銨溶液（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、0.7 mol/L NaCl溶液、酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）溶液、氯仿-異戊醇（24∶1）溶液、冰異丙醇。所有試劑均由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.1.3 培養基

MRS液體培養基：10 g蛋白胨，10 g牛肉浸膏，4 g酵母粉，2 g K2HPO4，1 g Tween-80，20 g葡萄糖，2 g檸檬酸三鈉，0.58 g MgSO4·7H2O，0.25 g MnSO4·4H2O，5 g三水乙酸鈉，1 000 mL蒸餾水。用于明串珠菌的分離培養，以及菌株的生理特征鑒定。

MRS固體培養基：在MRS液體培養基基礎上添加2%瓊脂粉。用于明串珠菌的分離培養。

MRS半固體培養基：在MRS液體培養基基礎上添加0.75%瓊脂粉。用于明串珠菌的分離培養。

BL固體培養基：20 g蛋白胨，10 g乳糖，5 g牛膽鹽，20 g瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，pH 7.4。用于明串珠菌的分離培養。

1.2 儀器與設備

GMSX280手提式壓力蒸汽滅菌器 北京中科路達實驗儀器有限公司；DNP-9022電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；Mastercycler nexus SX1聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀Eppendorf（中國）有限公司；DYY-12生化電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GDS-8000凝膠成像系統美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 明串珠菌的富集和分離純化

取適量白菜洗凈擦干、切成小塊后放入榨汁機打漿并過濾、離心然后加入NaCl至終質量濃度為3 g/100 mL，于121 ℃滅菌20 min。取5 g豆醬加入50 mL白菜汁液中，25 ℃密閉靜置培養7 d。無菌條件下，取培養7 d后的白菜汁液體1 mL，加入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，得到豆醬樣品質量濃度為10-2g/mL，按照10 倍稀釋法將樣品稀釋至10-8g/mL。取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/mL 5 個梯度樣品100 μL分別涂布接種于含2 g/100 mL CaCO3的MRS固體培養基、BL固體培養基，置于厭氧培養罐中，25 ℃恒溫培養48～72 h。挑取單個的明串珠菌典型菌落，純化2～3 次，直至得到單菌落。對獲得的單菌落進行革蘭氏染色并置于顯微鏡下觀察，將鏡檢結果為純培養物、具有明串珠菌細胞形態的革蘭氏陽性球菌穿刺于MRS半固體培養基或劃線轉入MRS固體斜面培養基中，低溫保存，供進一步實驗之用。

1.3.2 明串珠菌的形態特征和生理生化特征鑒定

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[23]，進行生態學特征和生理生化特征鑒定。

1.3.3 16S rDNA分子鑒定

采用CTAB法[24]提取明串珠菌基因組DNA，利用微量紫外分光光度計檢測疑似菌株的DNA濃度和純度。以明串珠菌疑似菌株基因組總DNA為PCR擴增模板，利用16S rRNA基因通用引物[25-26]27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3’）和1495R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增。50 μL PCR體系：10×PCR buffer（含Mg2+）5 μL，10 pmol/μL 27F和1495R各2 μL，dNTP Mix 4 μL，Taq DNA polymerase 0.6 μL。基因組DNA模板在反應體系內終質量濃度為200 ng/μL，剩余的體系體積用ddH2O補齊。PCR條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個循環；72 ℃、10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物送交至上海桑尼生物科技有限公司測序。將測序得到的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中標準菌株序列進行BLAST同源性比對，通過BLASTn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）完成序列比對。

1.3.4 明串珠菌的耐酸、耐膽鹽性能比較

益生菌若在人體內定植并發揮有益作用，就必須能夠耐受人體胃腸道的極端環境，根據人體胃腸道環境條件（進食后胃液的pH值不小于3.5，小腸膽鹽質量濃度基本保持在0.03～0.3 g/100 mL之間），本實驗將明串珠菌益生特性篩選的條件定為：pH 3.0、膽鹽質量濃度0.3 g/100 mL。將活化后明串珠菌2%（體積分數，下同）接種量接種于pH 3.0的現配MRS液體培養基中，25 ℃恒溫培養。采用傾注法對培養0、1、2、3 h的菌懸液進行活菌計數。將活化后明串珠菌以2%的接種量接種到含0.3 g/100 mL牛膽鹽的現配MRS液體培養基中，25 ℃恒溫培養。采用傾注法對培養0、2、4、6 h的菌懸液進行活菌計數。

1.3.5 分離株的保存

采用真空冷凍干燥法對菌體進行凍干保存。將明串珠菌菌株活化，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用滅菌生理鹽水沖洗菌體沉淀并混勻，再于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，再次收集菌體沉淀，如此重復2～3 次洗滌菌體。向菌體沉淀中加入15 g/100 mL滅菌脫脂乳1 mL，充分混勻后分裝于凍存管，預凍過夜后使用真空冷凍干燥機將其凍干，并置于-80 ℃的超低溫冰箱中保藏。

2 結果與分析

2.1 明串珠菌的分離結果

采用含2 g/100 mL CaCO3的MRS培養基和BL培養基對豆醬中明串珠菌進行分離篩選，因目前還沒有一種培養基能夠精確地從樣品中選擇性培養明串珠菌，故本實驗從豆醬中初步分離的菌株并不能確認為明串珠菌屬細菌，仍需要進行形態學、生理生化以及分子鑒定才能最終認定為明串珠菌。根據明串珠菌的形態學特征，挑取MRS固體培養基上培養48 h后菌落呈灰白色、表面光滑、邊緣整齊、黏稠有光澤、直徑約1 mm的菌株并保存。本實驗共從56 份豆醬樣品中初步分離出118 株菌株，經過形態學鑒定后，有81 株菌株為革蘭氏陽性菌，除去其中的34 株桿菌，剩余的47 株球菌被初步鑒定為明串珠菌疑似菌株。部分明串珠菌疑似菌株的革蘭氏染色鏡檢圖片見圖1。

圖1 部分明串珠菌疑似菌株的革蘭氏染色圖片（×100）Fig. 1 Gram staining of some suspected Leuconostoc strains (× 100)

2.2 明串珠菌的形態學特征和生理生化特征鑒定結果

從傳統豆醬中分離得到的47 株菌中，有22 株菌株的運動性以及在37 ℃、pH 6.5、pH 4.8、3.0 g/100 mL NaCl、6.5 g/100 mL NaCl和10%乙醇溶液條件下的生長情況（表1），與文獻[23]中記錄的明串珠菌特征基本一致。對符合明串珠菌菌株生理特性的22 株菌進行一系列生化實驗后，共有6 株菌株表現為過氧化氫酶（接觸酶）陰性、發酵葡萄糖產酸產氣、精氨酸水解陰性等特性，被初步認定為明串珠菌屬細菌。結合葡聚糖生成實驗（圖2）和碳水化合物利用實驗（表1）進一步表明：菌株MC3、LBQ、LBH不能生成葡聚糖，而菌株FX6、WQD、WDX能發酵產生葡聚糖。同時，6 株菌株均能夠利用果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖，但在阿拉伯糖、熊果苷、纖維素、纖維二糖、核糖、海藻糖、木糖的利用上均具有一定差異，因此根據文獻[23]將MC3、LBQ、LBH菌株鑒定為乳酸明串珠菌，而將FX6、WQD、WDX菌株鑒定為腸膜明串珠菌腸膜亞種。

表1 部分明串珠菌疑似菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of suspected Leuconostoc strains

圖2 部分明串珠菌疑似菌株葡聚糖生成實驗結果Fig. 2 Dextran production from sucrose by suspected Leuconostoc strains

2.3 明串珠菌的分子生物學鑒定

利用微量紫外-可見分光光度計檢測6 株明串珠菌疑似菌株DNA的濃度和純度，發現菌株的DNA質量濃度均在200 ng/μL左右，且OD260nm/OD280nm值基本處于1.6～1.8之間，符合PCR擴增體系的要求，可以進行下一步PCR擴增實驗。以獲得的明串珠菌疑似菌株DNA作為模板，按照PCR程序進行擴增。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測后發現，所有菌株的擴增產物均于1 500 bp處有單一明亮的條帶，符合測序工作的要求。將測序結果中6 株明串珠菌疑似菌株的16S rRNA序列進行同源性比對分析，得到6 株明串珠菌屬細菌，詳細結果見表2。

表2 明串珠菌16S rRNA序列同源性對比結果Table 2 Homology alignment of 16S rRNA sequences of suspected Leuconostoc strains

由表2可以看出，6 株菌鑒定結果均為明串珠菌（Leuconostoc）。其中菌株MC3、LBQ、LBH為乳酸明串珠菌（L. lactis），菌株FX6、WQD、WDX為腸膜明串珠菌腸膜亞種（L. mesenteroides subsp. mesenteroides），與形態學特征和生理生化特征鑒定結果一致。目前分子生物學鑒定最常用的是16S rDNA/rRNA序列分析技術，因16S rDNA/rRNA具有保守性，在漫長進化過程中幾乎保持恒定，可以由此進行物種的系統發育分析，同時又含有可變區域，能夠揭示出物種的特定核算序列，為分子生物學鑒定基礎。

2.4 明串珠菌的耐酸耐膽鹽性能比較

利用比濁法測定6 株供試菌株的生長曲線，利用菌懸液的濃度與混濁度呈正比的特性，采用分光光度計測量菌懸液的光密度來推算菌液的濃度。以測得的光密度OD600nm為縱坐標，以相應的培養時間為橫坐標作圖，繪制6 株明串珠菌屬細菌在6 h內的生長曲線，見圖3。

圖3 明串珠菌菌株生長曲線Fig. 3 Growth curves of six Leuconostoc strains

如圖3所示，6 株明串珠菌屬細菌生長曲線的趨勢相似，在0～2 h內生長較為緩慢，而在2～6 h內迅速生長，6 h后OD600nm均達到了1.200 0以上；其中，菌株MC3的生長速度最快，菌株WQD的生長速度最慢。

將6 株明串珠菌菌株分別接種到pH值為3.0的新鮮配制的MRS液體培養基中，于0、1、2、3 h進行傾注平板法活菌計數，結果如表3所示。

表3 明串珠菌酸耐受性實驗結果Table 3 Acid tolerance of Leuconostoc strains

如表3所示，明串珠菌在pH 3.0的MRS培養基中培養0～3 h，隨著時間的延長，菌株的活菌數大致呈下降趨勢。6 株菌對酸都有一定的耐受性，但菌株之間存在差異。其中菌株MC3、FX6、WDX的耐酸性較好，3 h后存活率分別為92.12%、85.16%、78.93%，不僅如此，菌株MC3和FX6在2 h后活菌數有所回升；菌株WQD對酸的耐受性最差，與0 h相比，在3 h后活菌數已經下降了一個數量級，存活率僅達到15.08%。

將6 株明串珠菌菌株分別接種到含0.3 g/100 mL牛膽鹽的新鮮配制的MRS液體培養基中，于0、2、4、6 h進行傾注平板法活菌計數，結果見表4。

表4 明串珠菌膽鹽耐受性實驗結果Table 4 Bile tolerance of Leuconostoc strains

如表4所示，6 株明串珠菌實驗菌株在含0.3 g/100 mL牛膽鹽的MRS培養基中培養0～6 h，隨著時間的延長，活菌數基本呈下降趨勢，但是下降的幅度不大，說明6 株菌對牛膽鹽都有一定的耐受性。縱向對比，菌株之間的活菌數各不相同，說明菌株之間對牛膽鹽的耐受性存在差異。橫向對比發現，菌株FX6、WDX、LBQ、WQD的膽鹽耐受性較好，6 h后存活率分別達到96.07%、88.75%、84.32%和83.06%；菌株LBH在6 株菌中對膽鹽的耐受性最差，培養6 h后存活率為60.53%。

綜上所述，菌株FX6、MC3、WDX對酸的耐受性較好，菌株FX6、WDX、LBQ、WQD對膽鹽的耐受性較好，故在6 株受試菌株中，菌株FX6、WDX的益生性較好。綜合考慮比較兩菌株在極端環境的存活率，菌株FX6在pH 3.0環境培養3 h后存活率達到85.16%，在含0.3 g/100 mL膽鹽環境培養6 h后存活率達到96.07%，故推斷6 株明串珠菌中菌株FX6的益生性最好。

人體胃排空時pH值約為3.0，進食后最低可達到1.5左右。人體腸道pH值一般為8.0，進食后食物經過小腸大概需要1～4 h，故一般實驗選擇能夠耐受酸和膽鹽的菌株作為待開發的益生菌株。益生菌能否耐受胃酸和膽鹽，是其能夠在腸道中存活下來并發揮益生功效的基本前提。趙小茜等[27]對4 株產多糖植物乳桿菌進行耐酸耐膽鹽性能實驗，以期獲得耐酸耐膽鹽的菌株，并將其投入生產實踐中。結果發現4 株植物乳桿菌在pH 3.5的條件下生長緩慢，而在pH 3.0和2.5的條件下幾乎不生長，而在0.3%的膽鹽環境下，3 株菌存活率達到65%以上。陳欣等[28]測定4 株人源乳酸桿菌耐酸耐膽鹽能力，結果表明4株乳酸桿菌能夠耐受pH 3的酸度（存活率6.6%～71.8%）和0.3 g/100 mL的膽鹽（存活率9.2%～31.8%）。楊曉宇等[29]對30 株不同來源乳酸菌進行耐酸耐膽鹽實驗，結果發現LS和LJ2菌株在pH 2.0環境下的存活率分別為135%和124%，LZ1株在pH 3.0環境下的存活率為137%，LJ1株對豬膽鹽有較高耐受能力，LT株對牛膽鹽有較高耐受能力。不同來源的益生菌耐鹽耐膽鹽性能均有差異。明串珠菌要作為益生菌在人體腸道內定植并發揮益生作用，就必須能夠耐受人體消化道中強酸和高膽鹽的極端環境。本實驗對豆醬分離篩選得到的6 株明串珠菌進行耐酸、耐膽鹽性能比較，發現菌株FX6、WDX能夠在pH 3.0和含0.3 g/100 mL質量濃度膽鹽的環境中良好生長。D’Angelo等[30]對奶制品中分離得到的29 株明串珠菌屬適應食品中應激性進行測定，發現乳酸明串珠菌的應激適應性最好，其次是腸膜明串珠菌，而Leuconostoc pseudomesenteroides和檸檬酸明串珠菌展現出最弱的應激適應性。菌株MC3、LBQ和LBH經鑒定為乳酸明串珠菌，菌株FX6、WDX和WQD為腸膜明串珠菌，但菌株MC3、LBQ和LBH的耐酸耐膽鹽性并沒有顯著優于菌株FX6、WDX和WQD，與D’Angelo等[30]研究結果不完全一致。現在已經可以通過技術手段利用腸溶膠囊等方法保護耐酸性弱的菌株通過胃部，故進行菌株篩選時，更看重菌株對人體腸道環境的耐受性。本實驗中菌株FX6、WDX、LBQ、WQD對膽鹽的耐受性較好，均可以做更深入的研究。

明串珠菌廣泛分布于環境中，根據人們長期食用含有明串珠菌的食品歷史來看，可以合理認為明串珠菌是安全的，而且目前沒有報道有人因食用明串珠菌發酵食品導致感染疾病[31]。但若將明串珠菌投入生產實踐，其安全性仍需進一步分析鑒定，針對本實驗中得到的菌株FX6，仍需通過吲哚實驗、硝酸鹽還原酶實驗、氨基脫羧酶實驗、溶血實驗、D-乳酸檢測及質粒提取實驗，確定菌株是否含有有害代謝產物及有無耐藥性[32]，從而鑒定菌株FX6的安全性。

3 結 論

本研究采用傳統分離純培養方法，從東北地區56 份傳統自然發酵豆醬樣品中成功獲得了118 株明串珠菌疑似菌株，通過形態學觀察、革蘭氏染色，47株菌株為革蘭氏陽性小球菌，6 株菌株符合明串珠菌屬細菌的生理生化特征。采用16S rDNA序列鑒定法對菌株進行種屬鑒定，結果顯示其中菌株MC3、LBQ、LBH被鑒定為乳酸明串珠菌，菌株FX6、WQD、WDX被鑒定為腸膜明串珠菌腸膜亞種ATCC 8293。利用比濁法測定并繪制6 株明串珠菌供試菌株的生長曲線，其中，菌株MC3的生長速度最快，菌株WQD的生長速度最慢。對所有菌株進行酸和膽鹽耐受性實驗，結果顯示菌株FX6、MC3、WDX對酸的耐受性較好，菌株FX6、WDX、LBQ、WQD對膽鹽的耐受性較好。綜合考慮，菌株FX6的益生性最好，在pH 3.0環境培養3 h后存活率可達85.16%，在含0.3 g/100 mL膽鹽環境培養6 h后存活率高達96.07%。接下來，對菌株FX6的安全性仍需做進一步的分析。