桐城風鴨產香真菌的篩選與鑒定

姚秀香，王 武,*，李沛軍，周 穎，童紅甘，張華鋒，葉 鍵

（1.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230001；2.安徽先知緣食品有限公司，安徽 桐城 231400）

桐城風鴨產于安徽桐城地區，它是由當地傳統的手工工藝，在自然條件下，低溫腌制、風干而成的一種傳統腌臘肉制品。風鴨貯藏時間長，蠟香濃郁，回味悠長，常作為款待親友的一道佳肴。國外對傳統腌臘制品的風味研究主要集中在火腿、發酵香腸等產品[1-2]，而在鴨肉腌臘制品發酵、風味等方面研究幾乎是空白。我國在風鴨風味方面研究主要側重于脂肪降解、氧化和蛋白質的分解等復雜的化學反應[3]，而微生物對風鴨風味的貢獻關注較少[4]。自然界中的微生物具有強大的酶體系和豐富的代謝產物，可能存在潛在的風味發酵劑。目前肉類工業發酵劑細菌關注較多，主要是乳酸菌和葡萄球菌。乳酸菌[5-7]作為發酵劑可以降低產品pH值和產生細菌素，有效抑制雜菌，其次乳酸菌代謝的乳酸能與醇類形成香味濃郁的酯類，而凝固酶陰性葡萄球菌[8-10]作為發酵劑能抑制生物胺，有效代替亞硝酸鹽，提高產品安全性，并形成很好的發酵風味。此外，研究表明酵母和霉菌能夠在制酒、醬油等產品中產生重要風味，利用釀酒酵母菌、黑曲霉菌、米曲霉制作微生物飼料，有效提高畜禽產品品質、改善肉類風味。在醬豬蹄中加入米曲霉、黑曲霉，得到外觀風味好、保質期長的產品[11-12]。一方面，酵母菌和霉菌真菌可能產生酯類化合物，賦予傳統干香腸的水果香味[13]。另一方面，真菌在傳統香腸中的潛在發酵作用尚未確定[14-15]。本研究從桐城風鴨中篩選產香真菌，分析產香菌株的揮發性代謝風味產物，以期為新型肉制品發酵劑的開發及桐城風鴨風味形成機制提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桐城風鴨由安徽先知緣食品有限公司提供。

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式酵母基因組、DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、孟加拉紅培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；腦心浸液肉湯培養基 青島海博生物技術有限公司；馬鈴薯 家樂福超市。

1.2 儀器與設備

S C I O N S Q四極桿氣相色譜-質譜（g a s chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀美國布魯克公司；SCIENTZ-09型無菌均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-6D型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；MINI4-UV型實驗室純水機科爾頓中國有限公司；2720thermalcycler型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、3730XL型測序儀 美國應用生物系統公司；FR980型凝膠成像儀上海復日科技儀器有限公司；DYCP-31DN型DNA電泳槽、DYY-5型穩壓電泳儀 北京六一儀器廠；CAR/PDMS固相微萃取針、57330U型固相微萃取手柄 美國Supelco公司；FINNPIPETTE F3移液器 美國Thermo Fisher公司；DB-5MS毛細管色譜柱 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 產香菌株感官篩選標準

產香菌株感官篩選標準在文獻[16]方法的基礎上，稍作修改和補充，如表1所示。

表1 產香菌株感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of aroma-producing fungi

1.3.2 產香菌株的分離純化

參考GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[17]。將風干后的鴨腿置于超凈工作臺上，按照無菌操作要求，用無菌解剖刀去骨后剪碎，四分法稱取25 g樣品加入225 mL 0.85%無菌生理鹽水置于無菌均質袋中，用拍打式均質器拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液，備用。用1 mL微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，注入9 mL稀釋液的無菌試管中，振蕩混勻，制成1∶100的樣品勻液，依次制備10 倍系列稀釋樣品勻液。換用100 μL微量移液器移取適宜的3～4 個質量濃度梯度鴨肉菌懸液100 μL分別涂布于孟加拉紅平板中，每組3 個平行，與此同時，吸取100 μL無菌生理鹽水加入3 個無菌平板內作空白對照，30 ℃培養5 d。根據菌落的顏色、形態、光澤等特點挑選出不同的霉菌、酵母，轉到新的平板上繼續培養、連續平板劃線，連續純化3 代后，將純化后的菌落純培養物接種試管斜面，于-4 ℃保存備用。

1.3.3 揮發性風味代謝產物分析

考慮菌株在不同的培養體系下可能會產生不同的代謝風味，經優化改良后的腦心浸液肉湯培養基被作為肉模擬體系的理想培養基[18]，實驗將純化后的菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖培養基和模擬肉體系中，并將未接種菌株的馬鈴薯葡萄糖培養基和模擬肉體系作為對照組，培養5 d，移取3 mL置于聚四氟乙烯密封的樣品瓶中，將75 μm CAR/PDMS萃取頭安裝入手柄后，插入聚四氟乙烯密封的10 mL樣品瓶中，緩慢推出纖維頭，使其暴露在樣品上部的頂空中，并與樣品保持一定距離，60 ℃水浴吸附40 min[19]，將萃取頭插入GC進樣口，250 ℃解吸2 min，推回纖維頭，拔出萃取針頭，進行GC分析，采用頂空固相微萃取結合GC-MS檢測揮發性代謝風味產物。

1.3.4 GC-MS條件

GC條件：DB-5MS毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；進樣口溫度與接口溫度均為250 ℃，程序升溫：柱初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min上升至60 ℃；再以10 ℃/min上升至100 ℃；接著以18 ℃/min上升至240 ℃保持6 min，檢測溫度240 ℃。載氣為He，流速0.3 mL/min；恒壓35 kPa，不分流[19]。

MS條件：離子源溫度200 ℃；電子電離離子源；電子能量70 eV；燈絲電流150 μA；質量掃描范圍m/z 33～450[19]。

1.3.5 化合物定性

利用美國布魯克GC-MS solution工作站與NIST 11 library數據庫檢索，匹配度達到800以上，確定其化合物。

1.3.6 分子學鑒定

基因組D N A提取按真菌和酵母提取試劑盒操作。P C R擴增霉菌I T S測序[20]，引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。酵母26S rDNA測序[21]，引物NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG，序列5’→3’。PCR體系：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL；10×Buffer（Mg2+）2.5 μL；dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL；酶0.2 μL；F（10 μmol/L）0.5 μL；R（10 μmol/L）0.5 μL；加雙蒸水至25 μL。PCR循環條件[22]：94 ℃保持4 min，預變性；94 ℃保持45 s，55 ℃保持45 s，72 ℃保持1 min，循環30次；72 ℃保持10 min，修復延伸；4 ℃∞終止反應。1×TAE緩沖溶液，1%瓊脂糖電泳，5 μL PCR產物，150 V、100 mA、20 min電泳觀察，PCR產物的測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。將測序結果登錄NCBI網站用BLAST程序進行序列比對，用軟件MEGA6.0構建系統進化樹。

1.4 數據處理

采用美國布魯克GC-MS solution工作站自帶軟件對原始數據進行繪圖并截圖，PhotoShop CC（2017版）軟件對圖像進行組合和標注，MEGA 6.0軟件構建生物系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 產香菌株的篩選

表2 產香酵母菌株的篩選Table 2 Screening of aroma-producing yeast Y1

采用孟加拉紅培養基分離桐城風鴨中的酵母菌，根據酵母的菌落形態分離出3株氣味良好的酵母，將不同的酵母純化后轉入PDA培養基中30 ℃培養5 d，每隔1 d進行感官評價，實驗結果如表2所示，與未接種菌株的空白組進行香氣比對，接種酵母Y1菌株的培養基產青草香、醇香，確定酵母Y1菌株代謝風味產物具有青草香、醇香類風味物質。

表3 產香霉菌菌株的篩選Table 3 Screening of aroma-producing mold M3

采用孟加拉紅培養基對桐城風鴨中的霉菌進行分離，根據霉菌的菌落形態和感官評價，分離純化出6株氣味良好的霉菌，將純化后的霉菌轉入PDA培養基中30 ℃培養7 d，每隔1 d進行感官評價，結果如表3所示，與未接種菌株的空白組進行香氣比對，接種霉菌M3菌株的培養基產酯香，初步確定霉菌M3菌株代謝風味產物具有酯香類風味物質。

2.2 產香菌株的形態學特征

圖1 產香菌株M3（A）和產香菌株Y1（B）的形態圖Fig. 1 Morphology of mold M3 (A) and yeast Y1 (B)

選用孟加拉紅和PDA培養基篩選、分離桐城風鴨中產香真菌，得到1株產香酵母Y1和產香霉菌M3，由圖1可知，產香菌株M3菌絲體發達，呈現白色絨毛狀，可初步確定為霉菌菌株。此外，實驗發現M3菌株在常溫和4 ℃低溫下生長，能夠在桐城風鴨的生產工藝中存活，生長周期在1周左右，且隨著菌株的生長，酯香味越來越濃郁。產香菌株Y1在孟加拉紅培養基內呈現玫紅色，且菌落比細菌大，生長周期長，初步確定為酵母菌株，篩選過程中發現Y1菌株生長周期在5 d左右，培養過程中產生的青香味濃郁，綜上，2株菌株均有作為發酵菌株的潛力。

2.3 產香菌株揮發性代謝產物分析

圖2 產香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養體系下的揮發性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 2 Volatile fl avor components from yeast Y1 cultured in PDA medium identi fi ed by GC-MS

采用頂空固相微萃取技術結合GC-MS法測定產香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養體系下的揮發性代謝風味產物，結果如圖2所示。與對照組相比，產香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養體系下，出現1-戊醇和苯乙醇兩個吸收峰。孫寶國[23]研究表明1-戊醇香氣閾值為4 000 μg/kg，帶有面包香、酒香和果香；而苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰樣花香，這種香味描述與實驗結果一致，因此，產香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養體系下代謝產生的青香味來自于1-戊醇和苯乙醇2種風味物質的共同作用。

圖3 產香酵母Y1在模擬肉體系下的揮發性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 3 Volatile fl avor components from yeast Y1 cultured in model meat system identified by GC-MS

考慮菌株在不同的培養體系下可能會產生不同的代謝風味，研究產香酵母Y1在模擬肉體系下的揮發性風味變化，采用頂空固相微萃取技術結合GC-MS法測定產香酵母Y1在模擬肉體系下的揮發性代謝風味產物，結果如圖3所示。與對照組相比，產香酵母Y1在模擬肉體系下同樣發現1-戊醇和苯乙醇2種風味物質吸收峰。實驗過程中發現產香酵母Y1能有效改善模擬肉體系的風味，進一步推斷這種風味的改變來自于1-戊醇和苯乙醇2種風味物質的共同作用。

通過對比馬鈴薯葡萄糖培養體系和模擬肉體系下揮發性代謝風味變化，進一步確定從桐城風鴨中篩選得到的產香酵母Y1能夠產生1-戊醇和苯乙醇2種揮發性香氣物質，1-戊醇被認為是蟹肉、兔肉、豬肉、魚肉和風干鴨肉等多種肉制品中的揮發性風味化合物[24]，將戊醇與醛類、酮類共同制作液體香精添加到食品或肉味香精中，能有效地提升其脂肪香氣[25]。苯乙醇具有玫瑰香，廣泛應用于釀酒工業、化妝品和香料中[26]，余冰等[27]研究認為苯乙醇是發酵肉制品的主體風味成分，產香酵母Y1有作為生物生產1-戊醇、苯乙醇的開發潛力，這將對桐城風鴨風味形成機制的探究提供一定的理論依據。

圖4 產香霉菌M3在馬鈴薯葡萄糖培養體系下的揮發性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 4 Volatile fl avor components from mold M3 cultured in PDA system identi fi ed by GC-MS

采用頂空固相微萃取技術結合GC-MS法測定產香霉菌M3在馬鈴薯葡萄糖培養體系下的揮發性代謝風味產物，結果如圖4所示。與對照組相比，實驗組接種產香霉菌M3后出現γ-癸內酯這種風味物質的吸收峰，且在馬鈴薯葡萄糖培養體系下接種產香霉菌M3后苯甲醛吸收峰明顯高于對照組。孫寶國[23]研究表明苯甲醛具有甜的果香、堅果香和花香，而γ-癸內酯具有蠟香、果香、奶油香、桃子香和椰子香氣，這與實驗中觀察的酯香味一致，因此，產香霉菌M3在馬鈴薯葡萄糖培養體系下產生的酯香味來自于苯甲醛吸收峰的增強和γ-癸內酯物質的出現。有研究表明[28]，苯甲醛賦予牛肉的堅果風味更易被消費者接受，此外，苯甲醛多次在鴨肉中檢測出[29]。研究表明[30]苯甲醛在大蒜揮發性風味物質的1.35%，這被認為是肉制品中因生產工藝引入苯甲醛的一種途徑；實驗中發現產香霉菌M3同樣能增強苯甲醛吸收峰的強度，相關研究表明霉菌存在多酚氧化酶[31]，這將可能是肉制品中苯甲醛吸收峰出現的另一種途徑。綜上，肉制品中的苯甲醛是來自加工工藝還是微生物的作用，以及產香霉菌M3如何增強苯甲醛吸收峰的形成機制，需要進一步論證，這將對桐城風鴨風味形成機制的探究提供一定的理論參考。

圖5 產香霉菌M3在模擬肉體系下的揮發性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 5 Volatile fl avor components from mold M3 cultured in model meat system identified by GC-MS

為進一步探究產香霉菌M3在不同體系下的風味變化，采用頂空固相微萃取技術結合GC-MS法測定產香霉菌M3在模擬肉體系下的揮發性代謝風味產物，結果如圖5所示。與對照組相比，產香霉菌M3在模擬肉體系下同樣出現苯甲醛吸收峰的增強，并且出現γ-癸內酯新的吸收峰。實驗過程中發現產香霉菌M3能有效改善模擬肉體系的風味，接種產香霉菌M3同樣能夠在肉模擬體系中產生酯香味，進一步確定這種風味的改變來自于苯甲醛和γ-癸內酯2種揮發性香氣物質的共同作用。通過對比馬鈴薯葡萄糖培養體系和模擬肉體系下揮發性代謝風味變化，進一步確定從桐城風鴨中篩選得到的產香霉菌M3能夠產生苯甲醛和γ-癸內酯2種揮發性香氣物質，γ-癸內酯是在香料工業中普遍應用的一種風味物質[32]，它對整體肉香味有重要貢獻，是調配燉煮雞肉風味香精的重要原料[33]。這將對桐城風鴨風味形成機制的探究提供一定的理論依據。

2.4 分子學鑒定結果

圖6 產香酵母Y1的26S rDNA（A）和產香霉菌M3的ITS（B）擴增片段凝膠電泳圖Fig. 6 Electrophoresis profiles of amplified 26S rDNA from yeast Y1 (A)and amplified ITS from mold M3 (B)

分別對產香酵母Y1和產香霉菌M3進行26S rDNA和ITS擴增，產香酵母Y1的26S rDNA和產香霉菌M3的ITS擴增片段凝膠電泳結果如圖6所示。產香酵母Y1和產香霉菌M3條帶大約長度為600 bp。將PCR擴增產物回收測序，結果表明產香酵母Y1測序片段長度為590 bp，產香霉菌M3測序片段長度為599 bp。將測序后得到的基因序列置NCBI進行BLAST分析，結果表明產香酵母Y1與涎沫假絲酵母（Candida zeylanoides）序列同源性相似為99%，產香霉菌M3與煙管菌（Bjerkandera）序列同源性相似為100%。

圖7 產香酵母Y1的26S rDNA相關菌株的系統發育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of yeast Y1 and related strains based on 26S rDNA gene sequence

圖8 產香霉菌M3的ITS相關菌株的系統發育樹Fig. 8 Phylogenetic tree of mold M3 strain and related strains based on ITS region sequence

使用Neighbor-Joining構建系統發育樹，產香酵母Y1的26S rDNA和產香霉菌M3的ITS相關菌株的系統發育樹結果如圖7、8所示。產香酵母Y1和產香霉菌M3分別與涎沫假絲酵母和煙管菌在發育樹上聚為一簇，具有較近的進化距離。綜上，Y1酵母經26S rDNA核苷酸測序分析鑒定為涎沫假絲酵母菌株，M3霉菌經ITS核苷酸測序分析鑒定為煙管菌株。

3 結 論

選用孟加拉紅和PDA培養基篩選、分離桐城風鴨中的產香真菌，得到1株產香酵母Y1和1株產香霉菌M3。Y1酵母經26S rDNA核苷酸測序分析鑒定為涎沫假絲酵母菌株，M3霉菌經ITS核苷酸測序分析鑒定為煙管菌株。采用頂空固相微萃取結合GC-MS技術，分別在馬鈴薯葡萄糖培養體系和模擬肉體系下進行這2株產香菌株的揮發性代謝風味產物分析，結果表明，該株涎沫假絲酵母在2種體系下產生的青香味可能來自于1-戊醇和苯乙醇2種物質的共同作用。而煙管菌在2種體系下產生的酯香味可能來自于苯甲醛和癸內酯2種風味物質的作用。此外，產香酵母Y1有作為生物生產1-戊醇、苯乙醇的開發潛力；產香霉菌M3有作為生物生產苯甲醛、γ-癸內酯的開發潛力。