響應面法優化草莓鮮榨汁紫外殺菌工藝

胡順爽，郜海燕*，吳偉杰，陳杭君

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.浙江省農業科學院食品科學研究所，農業部果品產后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，中國輕工業果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江 杭州 310021）

鮮榨純果汁是指未添加任何配料（包含水）的鮮榨果汁。隨著人們生活水平的提高以及保健意識的增加，鮮榨果汁越來越受到廣大消費者的歡迎。鮮榨果蔬汁將逐漸發展成為大眾化的健康飲品[1]。鮮榨果汁可以盡最大程度保留原有水果中的營養成分[2]。草莓屬于薔薇科草莓屬，是漿果類果實，色澤鮮艷、香味濃郁、營養成分含量較高，草莓中的VC、花色苷及總酚等具有很強的抗氧化性，具有一定的保健作用，其次草莓含水量高，果汁含量十分豐富，是制作鮮榨果汁的理想原料[3]。但是草莓果皮薄，組織嬌嫩，缺乏堅硬外皮保護，在收獲與運輸過程中極易受到損傷或遭受微生物侵染，從而降低草莓的商品利用價值。因此將草莓進行榨汁可以提高草莓的綜合利用價值。草莓鮮榨汁因為未加入任何防腐劑及添加劑，在生產過程中需要進行滅菌處理，以防止貯藏過程中草莓鮮榨汁被微生物侵染而腐敗。

紫外殺菌消毒作為一種有效控制微生物污染的物理冷方法，以其殺菌徹底、無化學殘留“綠色”等特點[4]，越來越為廣大學者們研究熱點。目前，紫外技術已經應用于液體、氣體和固體的殺菌，為保障人們的健康生活、提高生活品質發揮著重要作用。紫外殺菌消毒作為一種物理冷殺菌方式，相對于熱殺菌來說，主要依靠紫外線照射使得細胞內的DNA發生交聯，阻止DNA解旋復制，抑制微生物的繁殖[5]。研究發現紫外可以有效殺滅幾乎大部分的微生物[6]。由于殺菌過程中食品溫度幾乎維持不變，可以最大程度地保持食品的色、香、味及營養成分，并且紫外處理后食品不會留下殘留物[7]。Ochoa-Velasco等[8]在實驗室利用設計的紫外裝置完成對新鮮火龍果汁殺菌，測試了大腸桿菌（Escherichia coli）K12和酵母菌、甲第鞭毛蟲（Giardia）和隱孢子蟲（Cryptosporidium）的殺菌、殺蟲效果。Attic[9]和Matak[10]等利用紫外對牛奶和羊奶進行滅菌，并取得了不錯的效果。

本研究主要通過將紫外線滅菌應用于草莓鮮榨汁中，并利用響應面優化其殺菌工藝。主要目的是在草莓鮮榨汁滅菌過程中，盡最大程度減少草莓鮮榨汁營養成分的損失，同時達到國家相關標準的殺菌要求，從而延長其貨架期，提高草莓鮮榨汁的商品價值。以期為紫外線技術在液體食品加工中應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原材料“紅頰”草莓，采自浙江建德草莓園，摘取成熟度一致、無機械損傷及病蟲害的草莓，采摘當天運回實驗，4 ℃貯藏備用。

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基、酵母浸出粉、胰蛋白胨 上海盛思生化科技公司；牛肉膏 北京雙旋微生物培養基制品廠；瓊脂粉、氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HGB500榨汁機 美國Waring公司；icount10全自動菌落計數儀 杭州迅數科技有限公司；Cintra404紫外-可見光分光光度計 澳大利亞GBC科技儀器公司；MLS-3781L高壓蒸氣滅菌鍋 松下健康醫療器械株氏會社；VS-1306超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；80 目標準檢驗篩（孔徑0.2 mm）、100 目標準檢驗篩（孔徑0.15 mm） 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；PAL-1型數顯糖度計 日本愛拓公司；Metrohm 877 Titrinopius自動滴定儀 瑞士萬通公司；ArantiJ-E臺式離心機 美國Thermo公司。

紫外殺菌裝置：MRC-250B智能人工紫外氣候箱上海百典儀器設備有限公司；Philips 40 W低壓紫外燈。

1.3 方法

1.3.1 草莓鮮榨汁的制備

將草莓進行挑選、去蒂和清洗處理后，用榨汁機進行榨汁，分別用80 目和100 目的標準檢驗篩進行過篩過濾，再用200 目的濾布進行最后過濾，得到草莓鮮榨濁汁。將草莓濁汁放在4 ℃的冰箱中靜置12 h，待其分層后取上清液，即為草莓鮮榨汁[11]。實驗過程中為保證結果不受取樣的影響，每次實驗所需草莓鮮榨汁均一次制作完成，用消毒的玻璃瓶（體積150 mL，瓶口直徑4.2 cm，高7.9 cm）分別包裝后放置在4 ℃避光保存備用。

1.3.2 紫外殺菌條件單因素試驗

1.3.2.1 對照實驗

將未經過任何處理的草莓鮮榨汁樣品作為對照組，檢測其菌落總數、霉菌和酵母的數量，作為本實驗的初始值。

1.3.2.2 果汁厚度紫外殺菌率的影響

取6 個經過高溫滅菌的培養基（培養皿直徑90 mm，下同），通過控制草莓鮮榨汁的體積控制草莓鮮榨汁的厚度，分別將厚度設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mm，在紫外氣候箱功率40 W、照射時間65 min、照射距離12 cm的條件下進行草莓鮮榨汁的滅菌，測定其在不同果汁厚度下菌落總數、霉菌和酵母的數量，并計算殺菌率。

1.3.2.3 照射距離對紫外殺菌率的影響

取6 個經高溫滅菌的培養基，固定果汁厚度1.0 mm，照射距離分別設置8、12、16、20、24、28 cm，紫外氣候箱功率為40 W，照射65 min，測定其在不同照射距離下菌落總數、霉菌和酵母的數量，并計算殺菌率。

1.3.2.4 照射時間對紫外殺菌率的影響

取6 個經高溫滅菌的培養基，固定果汁厚度1.0 mm、照射距離12 cm、將照射時間分別設置為15、25、35、45、55、65 min，在40 W的紫外線照射下分別考察照射時間對草莓鮮榨汁殺菌率的影響。

1.3.2.5 照射功率對紫外殺菌率的影響

取6 個經高溫滅菌的培養基，固定果汁厚度1.0 mm、照射距離12 cm、照射時間55 min，分別在8、16、24、32、40、48 W的紫外線照射功率條件下進行草莓鮮榨汁滅菌，測定其在不同照射功率下菌落總數、霉菌和酵母的數量，并計算殺菌率。

1.3.2.6 微生物指標測定

菌落總數測定參考GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[12]，酵母菌和霉菌測定參考GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[13]。殺菌率按下式進行計算：

1.3.3 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，固定照射功率為40 W，以果汁厚度、照射距離和照射時間為試驗因素并以-1、0、1分別為自變量的低、中、高水平，以殺菌率為響應值，設計3因素3水平試驗，具體因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface methodology

1.3.4 品質指標測定

1.3.4.1 可溶性固形物

利用手持式數顯糖度計測定，讀數即為可溶性固形物含量，每個處理組做3 組平行，取平均值。

1.3.4.2 可滴定酸

利用自動滴定儀測定，其含量以檸檬酸體積分數表示。

1.3.4.3 VC含量測定

采用分光光度計法對草莓鮮榨汁進行VC的測定[14]。量取1 mL草莓汁，加入5 mL三氯乙酸溶液（50 g/L），離心，取上清液。取0.5 mL上清液于試管中分別加入20 g/L三氯乙酸溶液1.5 mL，無水乙醇1 mL，4%磷酸-乙醇溶液0.5 mL，5 g/L鄰菲羅啉-乙醇溶液1 mL，0.3 g/L三氯化鐵-乙醇溶液0.5 mL；對照組以0.5 mL三氯乙酸溶液代替草莓汁上清液，30 ℃反應60 min，于534 nm波長處測定吸光度。

1.3.4.4 花色苷含量的測定

參考胡位榮等[15]方法，采用pH示差法進行草莓鮮榨汁花色苷的測定。取1 mL草莓汁加入5 mL預冷的pH 3、75%乙醇溶液，4 ℃暗室浸提2 h，離心，取上清液。取0.025 mol/L氯化鉀緩沖液（pH 1）和0.4 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）各9 mL，加入1 mL上清液混合均勻，以蒸餾水作對照，用分光光度計測定510 nm和700 nm波長處的吸光度。

1.3.4.5 總酚含量的測定

參考李巨秀等[16]方法，采用Folin-Ciocalteau法進行草莓鮮榨汁的總酚含量測定。取1 mL草莓汁加入5 mL 60%乙醇提取液浸提2 h，離心。取1 mL上清液加入25 mL的具塞試管，加入3 mL福林-酚試劑后搖勻靜置5 min，分別加入6 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容25 mL，室溫下暗處放置2 h，于760 nm波長處測定吸光度。

1.4 數據統計

進行3 次重復實驗，并取平行值。響應面數據采用Design-Expert V8.0.6 軟件進行統計分析。另外采用Excel 2007、SPSS 22.0對數據進行分析處理，用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法多重比較進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 紫外殺菌條件單因素試驗結果

圖1 單因素對紫外殺菌率的影響Fig. 1 Effect of various factors on sterilization efficiency

新鮮制備的草莓鮮榨汁中菌落總數達到7.2 2×1 02C F U/m L，霉菌及酵母菌總數達到1.17×102CFU/mL，根據國家標準[12]，當果蔬汁中菌落總數超過100 CFU/mL時即超過衛生標準，不符合要求，因此應對草莓鮮榨汁進行殺菌。由圖1A可知，紫外對草莓鮮榨汁殺菌效果隨著草莓鮮榨汁的厚度增加而下降，兩者呈現負相關，草莓汁厚度在增加至1.0 mm以后，殺菌率開始出現下降。當草莓鮮榨汁厚度為1.0 mm時，對菌落總數的殺菌率達到99.46%，霉菌和酵母菌的殺菌率達到100%，當草莓原汁厚度增加至2.0 mm時，對菌落總數、霉菌和酵母菌的殺菌率分別降至94.09%和93%。由于紫外線的穿透力較差，液層厚度對紫外線的穿透率有著較大的影響，隨著草莓鮮榨汁厚度的增加，殺菌率降低，主要因為紫外線的穿透率隨著液層厚度的增加而降低[17]，紫外線強度減小，殺菌率降低。因此，綜合考慮，選取草莓鮮榨汁厚度為1.0 mm比較合適，即選取1.0 mm為響應面優化時自變量果汁厚度（X1）的零水平。

由圖1B可知，隨著紫外燈照射距離的增加，殺菌率呈現逐漸降低的趨勢。當紫外燈照射距離為12 cm時，紫外殺菌對霉菌和酵母菌總數及菌落總數的殺菌率分別為99.46%和100%，照射距離超過12 cm時，殺菌率開始出現下降。紫外照射距離為16 cm時，對霉菌和酵母菌總數及菌落總數的殺菌率分別下降至96.21%和96.03%，紫外燈照射距離為20 cm時，殺菌率開始明顯降低，殺菌效果減弱。這是因為紫外線強度系數隨距離增加減小從而影響了紫外輻射劑量。照射距離越大，紫外線強度越小，紫外的輻照劑量越小，對微生物的輻照損傷越小，殺菌率越低[18]。因此，綜合考慮，選取紫外燈照射距離為12 cm比較合適，即選取12 cm為響應面優化時自變量照射距離（X2）的零水平。

由圖1C可知，隨著紫外照射時間的延長，對草莓鮮榨汁的殺菌率呈現上升趨勢，兩者呈正相關。當紫外殺菌時間為15 min時，對霉菌和酵母菌總數、菌落總數的殺菌率分別為80.64%和78.57%。當紫外殺菌時間為55 min時，對霉菌和酵母菌總數、菌落總數的殺菌率分別增加至99.46%和99.2%。殺菌時間超過55 min后，殺菌率雖然有所增加，但是增加比較緩慢，此時草莓鮮榨汁中霉菌和酵母及細菌幾乎殺菌完全。照射時間與紫外輻照劑量成正比，殺菌時間越長，輻照劑量越大，殺菌率越高，但是輻照時間的延長會增加生產成本。因此綜合考慮，將照射時間55 min為響應面優化時自變量照射距離（X3）的零水平。

由圖1D可知，隨著紫外照射燈功率的增加，殺菌率呈逐漸增加趨勢，當紫外燈功率為8 W時，對草莓鮮榨汁的殺菌率比較低，當紫外殺菌功率增加至16 W時，草莓鮮榨汁的殺菌率明顯增加，對菌落總數、霉菌和酵母菌總數的殺菌率分別為92.47%和86.30%。當紫外殺菌功率達到40 W時，殺菌效果逐漸趨于平穩，對菌落總數、霉菌和酵母菌總數的殺菌率分別為99.87%和99.24%。這是因為紫外殺菌率受其輻射劑量的影響，輻射劑量越大，殺菌率越高[19]。綜合成本等因素，選取紫外照射功率40 W為響應面優化時自變量照射功率（X4）的零水平。但本實驗通過控制紫外燈管數量調節X4水平，平行分布的紫外燈照射強度不夠集中，功率準確性差。另外，殺菌容器位于紫外燈管正下方，紫外燈管的數量及中心位置影響殺菌容器位置，從而影響紫外強度和精度。因此，本實驗不采用X4零水平。本研究將固定5 根燈管（紫外燈殺菌功率約為40 W），每組實驗都固定殺菌容器在5 根燈管中心位置的正下方，以草莓鮮榨汁厚度（X1）、照射距離（X2）、照射時間（X3）作為響應面試驗影響因素，從而保障試驗的準確性。

2.2 響應面優化對草莓鮮榨汁殺菌結果

2.2.1 響應面優化試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，采用3因素3水平利用Design-Expert V8.0.6軟件按照Box-Behnken原理進行響應面設計，根據試驗設計確定方案對殺菌率進行優化，試驗方案及結果見表2。以菌落總數的殺菌率為響應值，以果汁厚度（X1）、照射距離（X2）、照射時間（X3）作為響應面試驗影響因素，方差分析見表3。采用Design-Expert軟件對試驗數據進行多項擬合回歸，得到紫外殺菌率對果汁厚度（X1）、照射距離（X2）、照射時間（X3）的二次多項回歸模型方程：Y=99.40-0.96X1-0.7X2+0.67X3+0.33X1X2+0.15X1X3-0.36X2X3-

由表3可知，該模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著，模擬的相關系數R2值為0.966 7，大于0.9，說明該模型與實際擬合良好，自變量與響應值之間的線性關系顯著，可用于草莓原汁紫外殺菌工藝實驗的預測[20]。另外，方差分析結果表明，草莓鮮榨汁厚度對響應值菌落總數殺菌率極顯著，照射距離、照射時間對響應值影響顯著。各因素的F值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，F值越大，表明對試驗指標的影響越大，即重要性越大[21]。結合表3可知，對草莓鮮榨汁殺菌率影響程度大小順序為果汁厚度＞照射距離＞照射時間。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design with experimental values of sterilization ef fi ciency

表3 回歸方差分析Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

2.2.2 響應面分析與結果優化

利用Design-Expert軟件對回歸方程構建響應面分析圖，分析各因素對殺菌率的影響，從其等高線可以看出兩個自變量之間的交互作用的顯著程度，其中圓形表示交互作用不明顯，橢圓形表示兩個變量之間交互作用明顯[22]。

由圖2可以看出，果汁厚度與照射時間，照射時間與照射距離交互作用對菌落總數殺菌率的影響具有顯著作用。果汁厚度和照射距離交互作用響應面圖較為平緩，等高線接近于圓形，因此果汁厚度和照射距離之間的交互影響不明顯。

圖2 任意兩變量對紫外殺菌率影響的響應面與等高線圖Fig. 2 Response surface plots and their corresponding contour plots showing the interactive effects of various variables on sterilization efficiency

通過對二次多項式數學模型的解逆矩陣，得出紫外輻照對草莓原汁的最佳殺菌條件為果汁厚度0.73 mm、照射距離8.0 cm、照射時間62.35 min，預測殺菌率為100%。

2.3 驗證實驗結果

為檢驗模型預測的準確性，采用響應面優化的工藝條件對草莓原汁進行紫外殺菌，考慮到實際性操作，將最優工藝條件調整為果汁厚度0.7 mm、照射距離8.0 cm、照射時間62 min，進行驗證實驗，并重復3 次，得到實際殺菌率為99.24%，與預測殺菌率100%非常接近，重復性好，說明該響應面法得到的紫外殺菌最佳工藝條件比較可靠，具有一定的實際指導意義。

2.4 紫外殺菌與巴氏殺菌對草莓原汁理化品質的影響

2.4.1 紫外殺菌對草莓鮮榨汁可溶性固形物和可滴定酸的影響

表4 外殺菌與熱力殺菌對草莓鮮榨汁可溶性固形物和可滴定酸的影響Table 4 Effects of ultraviolet and heat sterilization on TSS and TA of strawberry juice

由表4可知，對照、紫外殺菌及巴氏殺菌草莓原汁中可溶性固形物質量分數分別為7.3%、7.3%、7.4%，經過紫外殺菌及巴氏殺菌后的草莓原汁可溶性固形物沒有顯著性變化。可滴定酸含量經過紫外殺菌含量有所下降，但是下降幅度比較小，經過熱力巴氏殺菌后的草莓原汁可滴定酸下降比較大，說明紫外殺菌可以一定程度上緩解草莓原汁中的可滴定酸含量的降解。該結果與焦中高等[23]在短波紫外線輻照處理對采后甜櫻桃果實營養品質和抗氧化活性影響結果研究相一致。

2.4.2 紫外殺菌對草莓鮮榨汁VC含量的影響

VC在草莓原汁中含量比較豐富，是草莓原汁中重要的營養物質之一，VC很不穩定，受溫度影響比較大，加熱容易造成VC的嚴重損失[24]。如圖3所示，用紫外殺菌和巴氏殺菌后的草莓原汁維生素含量都出現下降，未經過處理的草莓原汁中VC含量為50.15 mg/100 g，經過紫外殺菌后VC含量下降為35.19 mg/100 g，VC含量下降29.8%，經過巴氏殺菌后草莓原汁VC含量為20.77 mg/100 g，比未處理草莓原汁下降了57.79%，紫外線殺菌對草莓鮮榨汁VC的破壞程度為巴氏殺菌的48%。主要因為加熱可以促進VC的氧化。紫外線照射可以抑制氧化酶的活力，緩解VC的氧化速率，提高VC的保存率，有利于VC的保持[25]。曾報道紫外對橙汁的殺菌實驗結果表明紫外線殺菌對橙汁VC的破壞程度為熱殺菌的36%[26]。本研究草莓鮮榨汁紫外殺菌對VC的影響與橙汁紫外線殺菌結果相一致。

圖3 紫外殺菌對草莓鮮榨汁VC的影響Fig. 3 Effect of UV sterilization on VC content

2.4.3 紫外殺菌對草莓鮮榨汁花色苷含量的影響

圖4 紫外殺菌對草莓鮮榨汁花色苷的影響Fig. 4 Effect of UV sterilization on anthocyanin content

草莓鮮榨汁含有豐富的花色苷，草莓中花色苷對熱不穩定，容易發生降解。花色苷中的二苯基并吡喃陽離子（AH+）的失電子過程AH+→A是放熱反應，水解反應AH+→B和開環反應B→C是吸熱反應并且伴隨著熵的增大。因此溫度升高時，平衡向著無色的甲醇假堿和查爾酮形式轉化，花色苷含量降解。由圖4可知，未經過滅菌的草莓原汁中花色苷含量為227.17 mg/g，經過巴氏殺菌后的草莓鮮榨汁中花色苷下降為185.24 mg/g，下降了18.46%，因為巴氏殺菌需要加熱，溫度升高，草莓鮮榨汁里的花色苷受熱降解。這與Lise等[27]在草莓花色苷穩定性研究中相一致。經過紫外線殺菌的草莓鮮榨汁，花色苷含量有所升高，含量為251.3 mg/g，與未滅菌的草莓鮮榨汁相比較含量升高了9.6%。因為紫外線可以促進草莓鮮榨汁中花色苷的快速合成和積累。這與焦中高等[23]在短波紫外線在櫻桃中應用研究結果相一致。

2.4.4 紫外殺菌對草莓鮮榨汁總酚含量的影響

圖5 紫外殺菌對草莓鮮榨汁總酚的影響Fig. 5 Effect of UV sterilization on total phenolic content

由圖5可知，草莓鮮榨汁在經過紫外滅菌后和巴氏殺菌后含量都有所上升，含量分別提高了10.7%和6.1%。紫外照射可快速激發草莓鮮榨汁中多酚物質的合成，說明酚類物質含量在短時內的升高可能緣于植物體對紫外線脅迫的快速應激反應，即在短時間內激發了合成酚類物質的苯丙烷代謝途徑。Erkan等[28]發現用紫外線照射藍莓后，在短時間內有利于藍莓總酚含量的提高。胡麗娜等[29]發現用短波紫外處理山楂果總酚含量與對照相比最高能升高7.28%。另外馬玉榮[30]發現經過巴氏滅菌后的豆漿總酚含量升高，解晚晴等[31]發現大豆經過高溫加工成豆制品后，比原來大豆的總酚含量增加。這些與本研究的結果相一致。

3 結 論

本研究以紫外為殺菌方法，應用SPSS和Design-Expert軟件得出紫外輻照對草莓鮮榨汁的最佳殺菌條件為果汁厚度0.7 mm、照射距離8.0 cm、照射時間62 min，殺菌率為99.24%。另外由于紫外線穿透厚度極小，在實際生產中可考慮采用鮮榨草莓汁在動態的條件下照射，如夾層薄流、噴霧照射等。另外在最佳紫外殺菌條件下，比較了傳統熱殺菌巴氏殺菌和紫外殺菌對于草莓鮮榨汁品質指標的影響，結果表明，紫外線殺菌對鮮榨草莓鮮榨汁可溶性固形物無顯著影響，但紫外殺菌可一定程度地緩解草莓鮮榨汁中可滴定酸在殺菌過程中的降解。另外，經過紫外線殺菌的草莓鮮榨汁中的VC含量有所下降，但是與巴氏殺菌相比較，VC損失率相對較小。經過紫外線殺菌后的草莓鮮榨汁中花色苷和總酚含量都有所增加。說明紫外線殺菌能達到商業無菌前提下，有助于草莓原汁中營養物質的保持。