生物膜干涉法檢測花生蛋白與花生過敏患者血清IgE的結合能力

張 英，李 坤，顏 琪，陳紅兵，吳志華,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330031；3.南昌大學資源環境與化工學院，江西 南昌 330031；4.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047）

花生作為一種較為普遍的食物或食品加工原料，屬于八大過敏原之一[1]，可引起嚴重的過敏反應[2-3]，在西方發達國家，花生過敏影響約1%～3%的兒童[4-5]?；ㄉ^敏的發生機制主要為免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導的I型超敏反應[6]，一定量的花生過敏原蛋白初次進入患者體內后，機體會產生與膜表面特定受體結合的IgE，使得機體處于致敏狀態。當相同的或相似的過敏原再次進入機體后，會與體內已有的IgE結合，引起多個FcεRI交聯，啟動活化信號，導致肥大細胞、嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放前列腺素、組胺等炎癥因子并出現炎癥反應[1,7-9]。

因此，檢測過敏原蛋白與過敏患者血清IgE的結合能力，或者其后由過敏反應引起的炎癥因子的釋放程度，是研究過敏原蛋白潛在致敏性強弱的重要指標。對于后者，檢測炎癥因子釋放的常用方法有細胞實驗和動物實驗，細胞實驗常采用肥大細胞或嗜堿性粒細胞進行，通過檢測過敏原刺激后細胞上清液中的組胺、β-己糖胺酶、IL-4等細胞因子的釋放、細胞內鈣離子的變化等指標反映過敏原的致敏能力[10-12]。動物實驗也被用于食物致敏性評估，一般使用特定種類的小鼠作為研究模型。小鼠與人類有很多生理學、基因和免疫學上的相似之處，它的整個免疫系統與人類也非常相似，于是可以通過模擬人體過敏反應的機制進行過敏原致敏能力的體內評估[13-14]。這兩種檢測方法均需要較長的培養時間、較大的人力物力消耗和較高的操作技術要求。

檢測過敏原蛋白與過敏患者血清IgE結合能力的常用技術為酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[15]，是一種將抗原抗體的免疫反應和酶的催化反應結合而建立的一門通過結合量的多少判定結合能力的技術。其中間接競爭ELISA方法較常用，但此方法的判定結果會受到較多因素的影響[16]，首先由于操作步驟繁瑣，很容易受到人為因素的影響，且多次洗板時容易發生孔間交叉污染、洗板不干凈等問題；另外實驗溫度也會通過加快或者減緩反應程度影響實驗結果；同時，ELISA測定方法具有一定的檢測限，在對雜交瘤細胞上清液抗體進行篩選時，當抗體的平衡解離常數（即親和力常數）低于10 pmol/L時，ELISA方法將無法區分其IgE結合能力強弱，而生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技術可以進行較好的分辨和篩選[17]。

已有研究表明[18-19]，BLI技術檢測分子間相互作用具有分辨率高、速度快、結果精準、可實現高通量以及不需要樣品前處理等優點。更重要的是彌補了ELISA容易受到人為因素影響以及只能檢測抗原抗體結合量的缺點，BLI技術通過傳感器的連續上機檢測聯合結合速率Ka與解離速率Kd計算得到親和力常數，親和力常數越小則說明其與血清IgE的結合能力越強，由此直接評估分子之間的結合能力強弱。

BLI技術所使用的傳感器光纖表面末端包裹一層特殊的光學膜，可以選擇性的結合相應生物分子，通過分子與分子之間的特異性相互作用在傳感器頭部形成分子層。當白光直射入傳感器，兩束光線將會反射到傳感器的末端。第1道光線由傳感器內表面反射而來，第2道光線來自于分子層。這兩束光線由于生物膜導致的干涉現象造成的波長變化與傳感器表面分子吸附分子質量有關。與表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術相比，BLI技術具有不受樣品組分變化影響的特點[20]，并因此應用廣泛，如Wallner等[19]使用鏈霉親和素（streptavidin，SA）傳感器檢測重組人紅細胞生成素與3 種不同脂質體的結合能力，發現1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿具有最強的結合能力。Morita等[21]檢測與大麻素具有高親和力的基因定點突變的Fv片段和野生型Fv片段分別與Δ9-四氫大麻酚的親和力常數，發現經過基因突變后的Fv片段具有比野生型高10 倍的結合能力。Sun Tingwan等[22]運用BLI技術檢測抗體自身相互作用從而可以在數小時之內進行大量抗體的篩選。

生物素-親和素的結合是一種很強的非特異性分子相互作用，能快速反應形成穩定的復合物[23]。本研究采用的SA傳感器表面固定有鏈霉親和素，偶聯生物素標記的羊抗人IgE抗體，形成穩定復合物，再特異性結合過敏患者血清IgE，之后令其與花生過敏原蛋白反應且經解離步驟檢測由于分子膜厚度變化引起的光譜波長位移變化，即可通過計算其親和力常數KD分析結合能力大小。

本實驗基于BLI技術利用SA傳感器、生物素化的羊抗人IgE抗體、花生過敏患者血清池以及花生蛋白建立了對花生蛋白與花生過敏患者血清IgE結合能力的檢測方法，并利用該方法對不同熱加工花生中蛋白與過敏患者血清IgE的結合能力進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生為購自江西南昌青山湖市場的新鮮贛花品種。

SA傳感器（18-5019） 美國ForteBio公司；生物素標記的羊抗人IgE抗體 美國Bio-Rad公司；花生過敏患者血清池（10 位花生過敏患者血清組成，特異性IgE的平均水平約66.5 IU/mL） 重慶曼紐艾克科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BLItz系統 美國ForteBio公司；1860酶標儀、Power Pac3000迷你蛋白垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；FDV型超細粉碎機 中國臺灣欣鎮企業有限公司；LEGEND MACH 1.6R高速冷凍離心機 美國Thermo公司；RH basic 2 S25磁力攪拌器 德國IKA公司；GBOX-CHEMI-XRQ凝膠成像系統 英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 條件優化

參考張峰等[24]的方法并略有改動，用0.01 mol/L pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）作為緩沖液，緩沖液中加入體積分數0.1%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和0.05%的Tween-20作為稀釋液，依次將生物素化的羊抗人IgE抗體、花生過敏原患者血清設置不同的濃度進行實驗，上機操作用量均為250 μL/孔，篩選實驗濃度和檢測時間。

1.3.1.1 生物素標記羊抗人IgE抗體稀釋倍數的確定

固化抗體作為生物傳感器檢測分子間相互作用中較重要的一個步驟[25]，可以提高實驗的高效性和特異性。采用不同稀釋倍數的生物素標記的羊抗人IgE抗體固化傳感器，比較固化信號曲線，觀察生物素標記抗體的結合情況。

高稀釋倍數的生物素標記抗體的結合曲線測定操作步驟為：傳感器預濕（緩沖液）10 min，平衡基線（緩沖液）30 s，固化（生物素標記抗體）1 800 s，封阻（稀釋液）300 s，洗基線（稀釋液）30 s。

低稀釋倍數的生物素標記抗體的結合曲線測定操作步驟為：傳感器預濕（緩沖液）10 min，平衡基線（緩沖液）30 s，固化（生物素標記抗體）1 200 s，解離（緩沖液）120 s。

1.3.1.2 血清稀釋倍數的確定

根據已優化的稀釋倍數稀釋生物素標記羊抗人IgE抗體，固化傳感器，將血清稀釋5、10 倍進行檢測，觀察信號變化。選擇較優曲線。

操作步驟為：傳感器預濕（緩沖液）10 min，平衡基線（緩沖液）30 s，固化（生物素標記抗體）350 s，封阻（稀釋液）300 s，洗基線（稀釋液）30 s，結合（血清）600 s，解離（稀釋液）120 s。

1.3.2 花生的熱加工

參考Zhang Wenju[26]和Sayers[27]等的方法略有改動。將新鮮花生進行不同形式的熱處理，分組為鮮花生未加工（XX）、鮮花生帶殼水煮（DZ，水煮15 min）、鮮花生去殼水煮（QZ，水煮15 min）、鮮花生帶殼烘烤（DH，170 ℃、80 min）、鮮花生去殼烘烤（QH，170 ℃、60 min）和鮮花生油炸（YZ，花生油150 ℃、400 s）。

1.3.3 脫脂粉的制備

參考Wu Zhihua等[28]的方法，將處理后的花生進行去殼去紅衣得到花生仁，用液氮在超細粉碎機研磨，并用質量體積比為1∶5的含有體積分數0.07%的β-巰基乙醇的丙酮在4 ℃條件下磁力攪拌脫脂2 h，抽濾，重復脫脂2 次，共脫脂3 次。3 次脫脂結束后抽濾并置于通風櫥風干至質量恒定即可。

1.3.4 花生蛋白的提取

參考Zhang Wenju等[26]的方法，采用Tris-HCl（20 mmol/L，pH 8.2）作為蛋白提取緩沖液，花生脫脂粉與蛋白提取緩沖液5 g/100 mL混合，于4 ℃磁力攪拌提取3 h，之后4 ℃、5 000×g離心5 min，取上清液，4 ℃、20 000×g再次離心30 min，收集上清液，用0.45 μm的濾膜過濾，并通過二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）試劑盒測定蛋白濃度。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參考詹少德[29]的測定方法略有改動。采用12%的分離膠和4%的濃縮膠制備單塊膠，蛋白樣品與上樣緩沖液1∶1混合，并煮沸加熱5 min，之后3 000 r/min離心3 min，每個樣品的上樣量為10 μL，設定條件為6 mA 30 min，12 mA 90 min，使得板中溴酚藍指示劑泳動到板底即可關閉電泳儀。使用考馬斯亮藍染色15 min后進行脫色，直至有清晰條帶出現。采用SDS-PAGE對花生蛋白進行分離并通過灰度掃描分析其平均分子質量，作為計算花生蛋白摩爾質量的數據用于BLI技術分析。

1.3.6 BLI技術檢測花生蛋白與過敏患者血清IgE的結合能力

用蛋白提取緩沖液將各蛋白樣品稀釋至1 mg/mL的質量濃度。蛋白提取緩沖液中加入體積分數0.1%的BSA和0.05%的Tween-20作為實驗稀釋液。根據相關研究[19-20]以及本研究的優化條件，本實驗的操作步驟分為線下處理和線上檢測，線下處理包括：傳感器預濕（蛋白提取緩沖液，100 μL/孔）10 min，固化（1∶100稀釋的生物素標記羊抗人IgE抗體，100 μL/孔）23 min，封阻（實驗稀釋液，100 μL/孔）20 min，結合（1∶10稀釋的花生過敏患者血清池，50 μL/孔）12 h，線上檢測包括：洗基線（實驗稀釋液，250 μL/孔）60 s，結合（花生蛋白，250 μL/孔）3 600 s，解離（實驗稀釋液，250 μL/孔）120 s。將上機數據結合各花生蛋白樣品的摩爾質量，計算親和力常數KD（KD=Kd/Ka），親和力常數越小說明其IgE結合能力越強。

1.3.7 間接競爭ELISA檢測花生蛋白與過敏患者血清IgE的結合能力

參考李坤等[30]的方法略有改動。10 μg/mL未加工鮮花生蛋白作為包被抗原，空白組用PBS代替花生蛋白；熱加工花生蛋白和未加工花生蛋白作為競爭抗原（質量濃度梯度設置為0.05、0.15、0.5、1.5、5 μg/mL），陽性對照組用PBS替代競爭蛋白參與反應，1∶80稀釋的花生過敏患者血清池作為一抗，1∶5 000稀釋的生物素標記羊抗人IgE抗體作為二抗，用1∶100稀釋的HRP標記的鏈霉親和素放大信號，最后加OPD溶液顯色15 min，酶標儀在490 nm波長處測量其OD值。陽性對照孔和實驗組OD值均扣除空白組OD值后分別標記為B0和B。以抑制率（抑制率/%=[1-（B/B0）]×100）值為縱坐標，以相對應的競爭蛋白濃度為橫坐標，繪制競爭ELISA曲線，根據IC50值的大小判定花生蛋白的IgE結合能力強弱，IC50值越小代表其IgE結合能力越強。

2 結果與分析

2.1 條件優化

2.1.1 生物素標記羊抗人IgE抗體稀釋倍數的確定

首先采用說明書建議ELISA使用的稀釋倍數：1∶4 000、1∶8 000和1∶12 000進行傳感器的固化30 min，得到結合曲線如圖1A所示：固化曲線的上升趨勢與稀釋倍數有良好的對應關系，但經過30 min的結合均未達到飽和，可能是由于固化抗體濃度過低引起的結合速率緩慢，因此選用低稀釋倍數進行固化，用1∶20和1∶100稀釋的抗體進行結合實驗，如圖1B所示，在100 倍的稀釋條件下仍然可以得到明顯的且可接受的結合信號，在短時間內可以達到平衡狀態，且不會發生明顯的解離，說明親和素與生物素的結合在此條件下是穩定的，考慮到試劑用量以及防止過多的抗體會產生擁擠，導致空間位阻和聚集效應，影響后續檢測，選擇100 倍稀釋的生物素標記羊抗人IgE抗體結合350 s進行下一步的優化，選用上機時間的4倍作為線下處理時長（即23 min）以達到同樣的效果進行花生蛋白與過敏患者血清IgE親和力的測定實驗。

圖1 測定條件的優化Fig. 1 Optimization of experimental conditions

2.1.2 血清稀釋倍數的確定

如圖1C可見，1∶5稀釋倍數下可能由于血清稠度的影響，結合曲線信號變化并不明顯，1∶10稀釋的血清具有明顯的結合信號。但是對進行結合時間表征時（圖1D），結合6 h后仍未達到飽和，考慮到結合效果以及實驗時間，本研究后續均采用10 倍稀釋的血清過夜結合的方法進行線下預處理。

2.1.3 檢測穩定性

圖2 檢測穩定性評估Fig. 2 Evaluation of the stability of the method

使用1∶100稀釋倍數的抗體，進行多個傳感器的重復實驗，從圖2A可以看到，這些結合曲線幾乎是相互重合疊加的。對于同一個樣品蛋白（帶殼烘烤鮮花生）進行結合實驗（圖2B），發現即使單獨分析（local分析模式）數據得到的親和力常數也是無顯著性差異的，故本研究中均不設置平行組。

2.2 BLI方法與ELISA方法檢測結果的比較

圖3 不同熱加工花生的蛋白SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE profiles of proteins from different heat treated peanuts

表1 不同熱加工花生蛋白分子質量Table 1 Relative molecular masses of proteins from different heat treated peanuts

圖4 BLI技術與ELISA檢測結果Fig. 4 Results of BLI and ELISA

使用SDS-PAGE分析結果（圖3，表1）計算得到的花生蛋白摩爾質量用于BLI技術分析，得到不同熱加工花生蛋白與花生過敏患者血清IgE的結合能力情況（圖4A、B）。將BLI方法的檢測結果與間接競爭ELISA的檢測結果比對，BLI方法檢測各花生蛋白的IgE結合能力的大小順序為：YZ＞XX＞QH＞DH＞QZ＞DZ，間接競爭ELISA檢測得到IgE結合能力的大小順序為：YZ＞XX＞QH＞QZ＞DH＞DZ（圖4C），兩者的檢測結果具有較高的匹配度，均表現為油炸鮮花生蛋白的IgE結合能力最強，帶殼水煮鮮花生蛋白的IgE結合能力最弱，去殼處理熱加工比帶殼處理熱加工花生的蛋白的IgE結合能力更強。用間接競爭ELISA的測定結果IC50值作為縱坐標，BLI技術檢測的KD值作為橫坐標，由圖4D可以看出，兩種檢測方法的結果之間具有很好的相關性（R2=0.91），因此BLI技術在檢測不同熱加工花生蛋白與花生過敏患者血清IgE的結合能力方面具有較好的可行性，可應用于評估花生過敏原蛋白的IgE結合能力。

相比于ELISA檢測方法，本研究得到的BLI技術操作簡便，上機一個程序只需要62 min，在使用多通道進樣設備，如OCTET RED384型號的設備時，可以同時檢測16個樣品，很容易實現高通量檢測，縮短檢測時間，且有望更進一步減少樣品需要量（最少40 μL/孔）。另外，BLI技術可以很大程度地減少人為誤差，且通過親和力常數可以更直接準確地反映花生蛋白與過敏患者血清IgE的結合能力，計算簡便。

2.3 熱加工對花生蛋白IgE結合能力的影響

根據人們的食用習慣，西方國家常常食用烘烤花生[5]，我國則較常食用水煮或油炸花生[26]，研究發現不同的加工方式會引起花生蛋白致敏性的不同[31]，故本研究將鮮花生進行了不同的熱加工處理，包括帶殼水煮、去殼水煮、帶殼烘烤、去殼烘烤和油炸，檢測不同形式的熱加工對花生過敏原蛋白與花生過敏患者血清IgE結合能力的影響。

高溫加熱會導致過敏原蛋白結構的改變主要是由于高級結構的解聚或聚集，使過敏原蛋白失去構象抗原表位、將表面抗原表位包埋或內部抗原表位暴露，從而影響IgE結合活性，降低或增加其致敏性[32-33]。在水煮過程中，也可能是由于水煮時部分花生蛋白會浸出到水煮液中或加工導致過敏原蛋白結構變化[34-35]，從而降低了提取得到的花生蛋白的IgE結合能力[36]。油炸花生同樣在較高溫度下制備而成，其花生蛋白的IgE結合能力升高可能與烘烤加工引起花生蛋白的IgE結合能力升高[36-37]原因相似，高溫加熱會導致聚合物[38]或美拉德反應終產物的產生，也可能會導致新的過敏原表位的出現，從而提高花生蛋白的IgE結合能力[31,39]。但本研究結果均表明烘烤加工降低了花生蛋白的IgE結合能力，這可能是由于花生蛋白的提取條件會影響過敏原蛋白的提取效率[40]，影響其過敏原的含量[41]。本研究所用緩沖液在提取烘烤加工后花生脫脂粉中的高分子質量聚合物時效果不顯著，從油炸花生中可以提取得到稍多的高于180 kDa的蛋白聚集體（圖3）。

在比較去殼水煮和帶殼烘烤兩組花生蛋白的IgE結合能力大小時，BLI方法檢測結果顯示去殼水煮較帶殼烘烤組略低，而ELISA檢測結果顯示去殼水煮較帶殼烘烤組有較高的IgE結合能力，這可能與檢測方法的不同有關。在Mondoulet等[35]的研究中，采用酶標記過敏原吸附實驗方法測定不同熱加工花生（生花生、水煮花生、烘烤花生）的IgE結合能力，發現水煮后花生的IgE結合能力僅為生花生的1/2，烘烤花生與生花生的IgE結合能力無明顯差別。而Maleki等[42]采用競爭抑制ELISA法發現烘烤可以提高花生蛋白的IgE結合能力。由此可見不同的檢測方法對于花生蛋白結合IgE能力的判定存在一定的影響。

另外本實驗還發現去殼處理熱加工均比帶殼處理熱加工的花生蛋白IgE結合能力強，這可能是由于去殼加工與帶殼加工得到的花生結構變化存在差異或者由于緩沖液對兩者的提取效率（圖3）不同而導致。

3 結 論

本研究利用BLI技術對花生蛋白與花生過敏患者血清IgE的結合能力進行表征，優化了檢測方法，優化的檢測條件為抗體1∶100稀釋后固化20 min，血清1∶10稀釋后過夜結合，完成傳感器修飾。洗基線后，將1 mg/mL的花生蛋白與傳感器結合3 600 s，并解離120 s，監測結合/解離曲線并計算親和力常數。研究顯示，BLI技術檢測結果與常用檢測方法ELISA具有較好的匹配性，二者結果的相關系數達到0.91。BLI技術能夠實現過敏原蛋白與血清IgE結合能力的高通量檢測，縮減檢測時間，減少人為誤差。研究還發現，不同方式的熱加工會不同程度地影響花生蛋白的IgE結合能力，其中油炸鮮花生蛋白的IgE結合能力最強，而其他熱加工均可降低蛋白的IgE結合能力，去殼處理熱加工花生蛋白比帶殼處理熱加工花生蛋白的IgE結合能力更強。