低溫乳化香腸加工過程中單核細胞增生李斯特氏菌的限量標準建議

江榮花，蘇 亮，任鵬程，孫琳珺，王 翔，劉 箐，董慶利,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

食品安全標準的制定是風險管理的首要內容，可用于監控消費者感染食源性致病菌的風險。近年來單核細胞增生李斯特氏菌感染事件頻發，部分國家均制定相應的食品安全標準，德國、荷蘭、加拿大、丹麥和法國規定“即食食品中單核細胞增生李斯特氏菌濃度不可超過2（lg （CFU/g））”，美國和意大利規定“25 g樣品中不得檢出單核細胞增生李斯特氏菌”[1]，我國GB 29921—2013《食品中致病菌限量》規定“25 g熟肉樣品中不得檢出單核細胞增生李斯特氏菌”[2]，而具體的熟肉類別有待進一步探究。

食品安全標準的制定需綜合考慮食品加工過程中的處理方式、污染和貯藏過程中食源性致病菌增殖的可能性以及消費者的易感性等因素[3-5]。食品安全目標（food safety objective，FSO）定義了消費時危害的最大頻率或最高濃度，可結合檢出率-劑量（prevalence-dose，PD）曲線法進行設定[6-7]，可用作即食肉制品中單核細胞增生李斯特氏菌的風險管理工具。食品安全期望常基于工廠的執行能力，而工廠執行能力的體現需將FSO轉化為執行目標（performance objective，PO）、執行標準（performance criteria，PC）和微生物標準（microbiological criteria，MC）等標準，MC的性能一般用操作特征（operating characteristic，OC）曲線進行描述。

低溫乳化香腸是以畜禽肉為主要原料，加入適當輔料經斬拌、灌裝、蒸煮和巴氏殺菌等加工工藝，中心溫度達到75～85 ℃并保持一定時間而制成的產品。其中，斬拌和灌裝過程的交叉污染、烘烤過程的失活以及貯藏過程中的生長對終產品中單核細胞增生李斯特氏菌的污染水平影響尤為顯著[8-9]。食品安全標準的制定可對食品加工鏈進行控制，減少加工過程中單核細胞增生李斯特氏菌的污染以及單核細胞增生李斯特氏菌增長至高濃度的可能性，從而降低食源性李斯特菌病發生的概率。

本實驗結合本課題組之前已完成的定量風險評估結果[10]和PD曲線法設定低溫乳化香腸的FSO，進而基于已設定的FSO進行推算，制定相應的PO、PC以及MC等食品安全標準，最后用OC曲線對已制定的采樣方案和MC性能進行評估，為微生物風險管理工作提供參考，完善風險管理體系。

1 材料與方法

1.1 PD曲線

PD曲線用于描述消費時引起相似風險的不同致病菌檢出率和消費劑量的組合，區分可容許和不可容許2 個區域，可測試檢出率和劑量的組合風險是否可容許[11]。應用@Risk 5.5軟件（美國Palisade公司）建立消費時單核細胞增生李斯特氏菌檢出率Pf和每餐消費劑量D之間的非線性關系[12]，選用的概率方法按式（1）計算：

式中：R為每年李斯特菌病總事件數；r為單位致病菌導致的發病率；Sall為高風險人群每年消費總餐次。

1.2 FSO、PO及PC的制定

1.2.1 FSO的制定

圖1 低溫乳化香腸加工過程單核細胞增生李斯特氏菌的風險管理模式Fig. 1 L. monocytogenes risk management during low-temperature emulsified sausage processing

單核細胞增生李斯特氏菌從驗收至消費整個加工階段的風險管理如圖1所示，參考相關文獻[13]得知消費時香腸樣品的單核細胞增生李斯特氏菌檢出率，同時根據本課題組已完成的香腸中單核細胞增生李斯特氏菌定量風險評估結果[10]確定消費劑量。通過PD曲線測試該檢出率和消費劑量組合是否可容許。應用@Risk 5.5軟件擬合消費時單核細胞增生李斯特氏菌的濃度分布，同時整合可容許的檢出率制定FSO。

1.2.2 PO的制定

應用Microsoft Excel 2010軟件進行低溫乳化香腸加工過程各環節PO的推算，選用的計算方法如式（2）、（3）所示：

式中：ΣI為危害水平的累積增加量，包括致病菌的污染量和/或生長量；ΣR為危害水平的累積減少量；Z為標準分數，計算方法如式（4）所示；S為默認的標準差（S=0.2，樣品中致病菌均勻分布，如液體食品；S=0.4，樣品中致病菌中度均勻分布，如碎牛肉；S=0.8，樣品中致病菌不均勻分布，如固體食品[14]）。

式中：μ、σ分別為致病菌濃度分布的均值、標準差。

1.2.3 PC的制定

PC為危害水平的減少量或最大可增加量，應用Microsoft Excel 2010軟件對低溫乳化香腸加工過程各環節PC進行推算，計算方法如式（5）所示[15]：

式中：H0為危害的初始水平，ΣI和ΣR如1.2.2節所述。

具體推算過程如等式（6）所示，貯藏是香腸加工過程的最終過程，因此貯藏過程的PO值可等于消費時的FSO值。任一過程的PO值是下一過程的H0值，如斬拌過程的PO值等于灌裝過程的H0值（PO1=H0-2）。

1.3 MC的制定

根據1.2節中已建立的FSO或PO值，建立相應的符合致病菌FSO和PO值的MC需做出以下假設：其一，定義采集樣品批次內致病菌的分布，一般假定為對數正態（lognormal）分布，分布的標準差采用缺省值：S=0.2，樣品中致病菌均勻分布，如液體食品；S=0.4，樣品中致病菌中度均勻分布，如碎牛肉；S=0.8，樣品中致病菌不均勻分布，如固體食品。其二，定義滿足FSO或PO的危害最大頻率或濃度。其三，定義不合格樣品不可接受的置信水平（Pd）。其四，定義樣品的分析單元大小[16]。

基于以上假定，樣品單元數（n）計算方法如式（7）所示：

式中：pa為一個樣品可接受的概率值，計算方法如式（8）所示：

式中：x為微生物限量（lg （CFU/g））；μ為微生物濃度分布的均值（lg（CFU/g））；σ為微生物濃度分布的標準差；cumulative為一個邏輯值：當Normdist返回累積分布時，設置為1；當Normdist返回為頻率分布時，設置為0。

1.4 OC曲線

OC曲線可用于描述MC的性能，應用Minitab 17軟件（美國Minitab公司）可建立基于樣本單元數（n）和可允許的陽性樣品數（c）的OC曲線；另一類基于生產者和消費者可接受安全水平的OC曲線[17]可用式（9）進行計算：

式中：Pa為一個批次樣品可接受的概率值；x、μ和σ如1.3節所述。

應用@Risk 5.5軟件擬合貯藏后樣品中致病菌濃度（μ, σ），將μ的擬合值帶入式（9）中計算出相應的Pa值，應用Microsoft Excel 2010軟件對μ-Pa的相關性進行描述。

2 結果與分析

2.1 低溫乳化香腸FSO的制定

圖2 消費時低溫乳化香腸中單核細胞增生李斯特氏菌的濃度分布Fig. 2 Probability distribution of L. monocytogenes upon consumption of low-temperature emulsified sausage

基于已完成的低溫乳化香腸加工過程中定量風險評估結果[10]，整合消費時樣品中單核細胞增生李斯特氏菌分布和樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出率可評估出樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的限量值m，如圖2所示。將圖2中2 組限量值轉化為劑量D（D=m×M，M為每餐香腸消費量（g）），并將劑量值（D）和檢出率（P）組合帶入圖3中進行驗證，由圖3可知，2 組PD組合（分別為P=1.35%、D=-2.92（lg CFU）和P=1.35%、D=2.02（lg CFU））均在可容許區域內。因此，圖2中限量值可設置為低溫乳化香腸的FSO。

圖3 低溫乳化香腸消費時的PD等值線Fig. 3 Prevalence-dose equivalence curve upon consumption of low-temperature emulsified sausage

基于斬拌和灌裝過程中單核細胞增生李斯特氏菌的交叉污染，低溫乳化香腸的FSO可設定為消費時低溫乳化香腸中單核細胞增生李斯特氏菌污染水平不可超過0.36（lg（CFU/g））或消費時污染單核細胞增生李斯特氏菌的低溫乳化香腸需低于1.35%。未整合斬拌和灌裝過程中單核細胞增生李斯特氏菌的交叉污染時，低溫乳化香腸的FSO可設定為消費時低溫乳化香腸中單核細胞增生李斯特氏菌污染水平不可超過-4.58（lg（CFU/g））或消費時污染單核細胞增生李斯特氏菌的低溫乳化香腸需低于1.35%。由整合和未整合交叉污染的FSO設定結果可知，未整合斬拌和灌裝過程中單核細胞增生李斯特氏菌交叉污染的FSO值明顯低于整合交叉污染的結果，低估了低溫乳化香腸的食用風險。

2.2 低溫乳化香腸PO和PC的制定

表1 低溫乳化香腸加工過程中各環節PO及PC的設定Table 1 Setting of PO and PC during low-temperature emulsi fi ed sausage processing

如表1所示，以烘烤過程為例，基于斬拌和灌裝過程中單核細胞增生李斯特氏菌的交叉污染，香腸烘烤時的PO可設定為烘烤時低溫乳化香腸中單核細胞增生李斯特氏菌污染水平不可超過-2.32（lg（CFU/g））或烘烤時污染單核細胞增生李斯特氏菌的低溫乳化香腸需低于23.3%；未整合斬拌和灌裝過程中單核細胞增生李斯特氏菌的交叉污染時，香腸烘烤時的PO可設定為烘烤時低溫乳化香腸中單核細胞增生李斯特氏菌污染水平不可超過-7.26（lg（CFU/g））或烘烤時污染單核細胞增生李斯特氏菌的低溫乳化香腸需低于23.3%。

基于制定的PO值，相應的香腸烘烤時的PC設定結果為：整合交叉污染時，烘烤過程中需確保6.56（lgCFU）的單核細胞增生李斯特氏菌減少量；未整合交叉污染時，烘烤過程中需確保5.33 （lg CFU）的單核細胞增生李斯特氏菌減少量。另以貯藏過程為例，香腸貯藏時的PC設定結果為：整合交叉污染時，貯藏過程中單核細胞增生李斯特氏菌的增加量不可超過5.68（lgCFU）；未整合交叉污染時，貯藏過程中單核細胞增生李斯特氏菌的增加量不可超過4.54（lgCFU）。由整合和未整合交叉污染的PO及PC設定結果可知，整合斬拌和灌裝過程中單核細胞增生李斯特氏菌交叉污染的PO及PC更為嚴格。

2.3 低溫乳化香腸加工過程各環節MC的制定

表2 低溫乳化香腸加工過程中各環節的采樣方案Table 2 Sampling plans for different steps of low-temperature emulsi fi ed sausage processing

如表2所示，以貯藏過程為例，香腸貯藏時的MC制定結果為：整合交叉污染時，樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的濃度分布為μ=-3.27（lg（CFU/g）），σ=1.64，分析單元大小為25 g，獨立采樣所得樣品單元為222，允許的陽性樣品單元為0，單核細胞增生李斯特氏菌限量值為0.36（lg（CFU/g））；未整合交叉污染時，樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的濃度分布為μ=-7.48（lg（CFU/g）），σ=1.31，分析單元大小為25 g，獨立采樣所得樣品單元為222，允許的陽性樣品單元為0，單核細胞增生李斯特氏菌限量值為-4.58（lg（CFU/g））。由表2可知，驗收、烘烤和貯藏過程中，未整合交叉污染的采樣數高于整合交叉污染的結果，因此，考慮生產成本和經濟性，整合交叉污染的過程耗費的人力和物力更少。

以灌裝和烘烤過程為例，綜合表1、2可知，烘烤過程結束時，低溫乳化香腸污染單核細胞增生李斯特氏菌的最大污染水平低于灌裝過程，同時基于理論推導可知，烘烤過程檢出單核細胞增生李斯特氏菌陽性的低溫乳化香腸數低于灌裝過程（0.233×12＜0.013×224）。

2.4 兩類評估MC的OC曲線

2.4.1 基于樣本單元數和可接受水平限量值的OC曲線

圖4 基于樣本單元數和可接受水平限量值的OC曲線Fig. 4 OC curves based on the number of samples tested and the maximum number of those samples that may exceed the specified level

以驗收過程為例，圖4A中，假設樣品中10%缺陷率的限量，則Pa=0.04，表明檢測缺陷率為10%的樣品時，100 次檢測中有4 次可能得到30 份檢樣中有0 份檢樣為陽性的情況，因而接受；但若100 次檢測中有96 次得到30 份檢樣中有大于等于0 份檢樣為陽性的情況，則拒絕（Pd=0.96）。未整合交叉污染的場景如圖4B所示，假設樣品中10%缺陷率的限量時，Pa=0.18＞0.04，Pd=0.82＜0.96，因此，相同樣品單元缺陷率的批次在整合交叉污染的場景下被視為“可接受”的概率較低，因此整合交叉污染的采樣方案更為嚴格。

圖4反映了在特定可接受限量條件下，不同加工過程的可接受概率從100%降至0%時對某批產品可接受或不可接受的判別力。批次的樣品單元（n）越大，OC曲線越陡峭，采樣方案越接近理想狀態。因此，整合交叉污染的場景下（圖4A），不同加工過程采樣方案的嚴格性排序為灌裝＞貯藏＞驗收＞烘烤＞斬拌；未整合交叉污染的場景下（圖4B），不同加工過程采樣方案的嚴格性排序為貯藏＞烘烤＞驗收。

2.4.2 基于生產者和消費者可接受安全水平的OC曲線

以貯藏過程為例，整合交叉污染的貯藏過程OC曲線和相應的消費者及生產者可接受安全水平的濃度分布情況如圖5a～c所示，圖5a展示了95%拒絕水平（消費者可接受安全水平）和95%可接受水平（生產者可接受安全水平）下單核細胞增生李斯特氏菌的平均污染水平，圖5b反映了消費者的可接受安全水平，平均污染水平為-0.53（lg（CFU/g））的批次有95%的概率被拒絕，同時99%點對應的濃度水平0.36（lg（CFU/g））可設定為FSO值，確保99%的樣品單元不超過FSO值，圖5c展示了生產者的可接受安全水平，平均污染水平為-1.04（lg（CFU/g））的批次有95%的概率被接受。

圖5 基于生產者和消費者可接受安全水平的OC曲線Fig. 5 OC curves of the acceptable level for safety of producer and consumer

未整合交叉污染的貯藏過程OC曲線和相應的消費者和生產者的可接受安全水平的濃度分布情況如圖5d～f所示，圖5d為95%拒絕水平和95%可接受水平下單核細胞增生李斯特氏菌的平均污染水平分布，圖5e為消費者的可接受安全水平分布，平均污染水平為-5.46（lg（CFU/g））的批次有95%的概率被拒絕，同時99%點對應的濃度水平-4.58 （lg（CFU/g））設定為FSO值，圖5f為生產者的可接受安全水平分布，平均污染水平為-5.99（lg（CFU/g））的批次有95%的概率被接受。由整合和未整合交叉污染的貯藏過程OC曲線對比結果可知，未整合交叉污染的場景高估了消費者風險（-5.46＜-0.53，食品批次應該被拒絕時卻被接受），同時低估了生產者風險（-5.99＜-1.04，食品批次應該被接受時卻被拒絕）。

3 討 論

3.1 微生物風險管理中食品安全標準的概念

近年來食品安全事件頻發，基于制定科學合理的食品安全標準的理念，國際食品微生物標準委員會（International Commission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF）提出適當保護水平（appropriate level of protection，ALOP）的概念，定義為：成員國制定并認為適當的衛生或植物檢疫措施以保護本國人、動物或植物的生命或健康的保護水平[1]。ALOP可以用于衡量食品衛生標準的科學合理性，屬于國家水平上的公眾健康目標，范圍較為寬泛、抽象，因此在食品工廠設定FSO方面，并不是一個有效方式[18-19]。因此，ICMSF提出FSO的概念，用于連接ALOP和食品供應鏈的目標點。

FSO定義為在能夠提供適當保護水平的基礎上，消費時食品中微生物危害的最大頻率和/或最高濃度[1]。FSO的設置需結合消費前食品加工鏈中所有控制點污染的可能性和影響，因此，食品法典委員會提出PO和PC的概念，PO定義為：在確保FSO或ALOP實現的基礎上，消費前食品加工鏈的某階段食品中危害的最大頻率和/或最高濃度。PC定義為：通過采取一項或多項控制措施，控制食品中有害因素的發生頻率和濃度，以滿足PO和/或FSO的要求[20]。基于微生物學檢測驗證PO和PC需建立相應的MC。

MC定義為：基于單位質量、體積、面積或批次中微生物（包括寄生蟲）和/或其毒素/代謝產物的有無或數量判定某一產品或食品批次的可接受性[21-22]。MC的主要內容包括：樣品中致病菌的濃度分布（μ, σ）；適宜于食物鏈特定環節的微生物限量；定義采集樣本數量和大小的采樣方案[23]。歐盟法規設立了2 類MC：食品安全標準和加工衛生標準。食品安全標準是某一產品或食品批次應用于市場銷售的可接受性；加工衛生標準表明產品加工過程運作的可接受性[24]。一般用OC曲線描述MC的性能。

OC曲線是指基于測試的樣本單元數、樣品單元的比例或批次等份和特定的可接受水平（如最大可容忍缺陷率）判定批次樣本可接受的概率曲線。OC曲線主要用2 個指標進行描述：樣本單元數（n）和可允許的陽性樣本單元數（c），這類OC曲線主要用于評估采樣方案的性能[1,25]。另一類整合樣品批次中致病菌濃度分布的OC曲線可用于評估MC的性能，MC性能的評估依據主要是檢驗食品批次是否滿足FSO或PO[11]。

3.2 FSO制定方法的比較和選擇

FSO的制定方法主要包括正序法、倒序法和PD曲線。基于流行病學數據的正序法是國家水平上較好的風險評估方法。正序法一般使用反向劑量效應模型進行評估，假定特定的交叉污染路徑為唯一影響消費時食品中致病菌污染水平的因素，因此模型進行參數設置時，輸入值的不確定性和變異性較小，但是數據質量要求較高[21-22]。基于食品供應鏈數據的倒序法是國際水平上較好的風險評估方法。倒序法構建的模型較為復雜，因此模型中所需數據的獲得具有很大挑戰性。模型的輸入值較多，因此累積在風險特征描述階段的不確定性和變異性較大，但是特定致病菌的陽性檢出率和濃度數據較易獲得[26]。暴露量主要受交叉污染過程中介質數量、介質類型及污染路徑等因素影響，因此FSO的制定需使用細胞數定義風險。對比采用正序法和倒序法制定FSO，PD曲線使用食品消費劑量代替食品中致病菌的濃度或陽性檢出率進行制定更為全面[6]。

本研究中采用PD曲線，同時整合消費時樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的分布和樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出率對低溫乳化香腸的FSO進行制定，結果表明，整合和未整合交叉污染的結果均在可容許區域內，因此2 種場景均可用于低溫乳化香腸FSO的制定。Havelaar等[6]研究結果表明，FSO的定義需修正為考慮食品中致病菌污染的變異性和不確定性、食品中致病菌的陽性檢出率和濃度分布，因此建議采用PD曲線用于FSO的制定。Gkogka等[27]研究并比較了正序法和倒序法2 種風險評估方法制定荷蘭雞肉的FSO，結果表明，2 種方法得到的FSO值具有顯著性差異（P＜0.05），可能因為方法不同或可得到的數據有限影響了FSO的制定，與Konstantinos等[26]的研究相似。關于低溫乳化香腸FSO制定方法的選用可為風險管理者提供借鑒。

3.3 整合交叉污染對食品安全標準制定的影響

食源性致病菌的交叉污染是指制作表面污染致病菌的食品時操作不當污染到其他食品[28]。香腸加工過程的斬拌和灌裝過程交叉污染現象尤為嚴重。本研究表明，對比未整合交叉污染的食品安全標準制定結果，整合交叉污染的結果更為嚴格，且過程中耗費的人力物力更少。單核細胞增生李斯特氏菌廣泛存在于香腸加工環境中，同時可在香腸貯藏環境中生長，因此關于香腸樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出報道頻發[29-31]。香腸加工過程中，斬拌機或灌裝機等設備清洗不當或操作人員衛生不合格均會造成單核細胞增生李斯特氏菌的交叉污染。Gkogka等[27]采用Spearman相關系數對影響FSO制定的因素進行敏感性分析，結果表明交叉污染是影響FSO制定的重要因素（Spearman相關系數為0.39）。關于香腸加工過程中單核細胞增生李斯特氏菌交叉污染的研究可為香腸加工過程中完整的風險管理研究提供借鑒。

4 結 論

本實驗研究交叉污染對低溫乳化香腸加工過程中食品安全標準制定的影響，結果表明，整合交叉污染的標準制定結果更為嚴格，且過程中耗費的人力物力更少。評估制定的采樣方案和MC，結果表明，整合交叉污染的采樣方案較為嚴格，未整合交叉污染的場景高估了消費者風險，同時低估了生產者風險。比較了已制定的食品安全標準、GB 29921—2013和其他國家食品安全標準，為微生物風險管理工作提供參考。