高效液相色譜-串聯質譜測定食品中15 種有毒生物堿

范素芳，馬俊美，劉 茁，俞 婧，翟洪穩，李 強,*，張 巖,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091；2.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

生物堿是存在于自然界（主要為植物）中的一類含氮堿性有機化合物，大多數生物堿具有復雜的環狀結構，并且具有明顯的生物活性[1]。生物堿廣泛存在于毛茛科、蕓香科、豆科等植物的根、果實中，很多食品中也含有生物堿，如馬鈴薯中含有配糖生物堿龍葵素、茄子中含有茄堿、檳榔中含有檳榔堿等[2]。很多生物堿是中藥的有效成分，如嗎啡能鎮痛，麻黃堿可以止咳平喘，喜樹堿、秋水仙堿具有抗癌作用等，生物堿具有生物活性的同時也具有毒性，必須控制其用量，攝入量過大時會產生副作用[3]。生物堿是引發食物中毒的主要原因之一。馬鈴薯尤其是發芽的馬鈴薯中含有龍葵素，常有因食用了發芽的馬鈴薯而引發的中毒案例，而且通常為群體性事件[4]。烏頭堿、顛茄堿（阿托品）、東莨菪堿、秋水仙堿、馬錢子堿、鬼臼毒素等生物堿由于具有毒性，在臨床應用的同時也會因使用不當造成食物中毒[5-10]。因此檢測糧食谷物、果蔬、植物飲料中有毒生物堿對保障食品安全非常必要。本實驗選擇糧谷類玉米粉、面粉、鍋巴和薯片，選擇果蔬類番茄、茄子、桃和土豆，選擇植物源飲料山楂汁、雪梨汁、芒果汁和王老吉，其中土豆中易含龍葵素，茄子中有茄堿，植物源飲料中易混入烏頭堿、莨菪堿、馬錢子堿等有毒生物堿的成分。

目前，生物堿的檢測方法主要有高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-串聯質譜法[7,14-17]、氣相色譜-串聯質譜法[18-19]、高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜[20-21]等，樣品基質多為生物樣品。Murauer等[22]用超臨界流體色譜測定金雞納樹皮中喹啉類生物堿，其中定量測定了金雞納堿、奎寧和金雞納啶。Li Lou等[23]用雙環糊精系統的毛細管電泳分離并測定了4 種鉤藤堿。Long Zhen等[24]用強離子交換二維液相色譜測定了莨菪烷生物堿。段存賢等[25]用氨基鍵合硅膠為固定相的正相高效液相色譜法測定神農丸中士的寧與馬錢子堿的含量。丁琳等[26]建立了莨菪浸膏片的高效液相色譜特征指紋圖譜，并對其中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、樟柳堿4 種莨菪烷類生物堿進行定量分析。已經有火鍋底料[27]及罌粟殼[28-29]中生物堿的高效液相色譜-串聯質譜方法，秦軍燕等[30]建立了肉蓯蓉、枸杞和山藥中6 種生物堿的高效液相色譜-串聯質譜方法，賀琦等[3]建立了紅酒、牛奶、面包和玉米粉中20 種有害生物堿的高效液相色譜-串聯質譜方法。但大宗食品中有毒生物堿的高效液相色譜-串聯質譜方法鮮見報道。本實驗建立了糧谷、植物源性飲料、蔬菜、水果中茄堿、東莨菪堿、馬錢子堿、士的寧、麻黃堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、檳榔堿、毒芹堿、鬼臼毒素、毛果蕓香堿及鉤吻堿15 種生物堿的高效液相色譜-串聯質譜測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物源性飲料：山楂汁 北京京膳堂飲料有限公司；冰糖雪梨 康師傅控股有限公司；芒果汁 韓國樂天集團；涼茶飲料 廣州王老吉藥業股份有限公司。糧谷類樣品：小米鍋巴 良品鋪子股份有限公司；薯片美國樂事公司；面粉、玉米粉 市購。果蔬樣品：番茄、茄子、桃、土豆 市購。

乙腈、甲醇、乙醇（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；正己烷（分析純） 北京化學試劑公司；甲酸（色譜純） 美國Supelco Analytical公司；去離子水 屈臣氏集團（香港）有限公司；15 種生物堿標準品（純度≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；陽離子交換柱（3cc，60 mg） 美國Waters公司。

1.2 儀器與設備

Triple Quad 6500液相色譜-串聯質譜儀（配有電噴霧離子源和MultiQuant 3.0.1數據處理系統） 美國AB Sciex公司；3K13高速冷凍離心機 德國Sigma公司；渦旋混勻儀 德國IKA公司；KQ-500DB超聲儀 昆山市超聲儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制及試樣制備

標準溶液的配制：分別稱取各標準物質10 mg置于100 mL容量瓶中，用體積分數20%乙醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，制得100 mg/L的標準儲備液，于-20 ℃避光保存，可使用2 個月。根據實驗需要，用20%乙醇溶液將標準儲備液配制成不同質量濃度的標準工作溶液，現配現用。

液態樣品進行搖勻；固態樣品粉碎均勻；果蔬樣品切碎后勻漿。制備好的試樣于0～5 ℃保存，盡快測定。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 液態試樣

稱取1.000 g植物源性飲料于離心管中，加入20%乙醇溶液定容至20 mL，9 500 r/min離心10 min，吸取1.0 mL上層清液，0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.2.2 固態樣品（糧谷類）

取1.000 g樣品加入10 mL 20%乙醇溶液，超聲提取30 min，9 500 r/min離心10 min，過濾，收集濾液。殘渣用10 mL 20%乙醇溶液重復提取1 次，合并濾液，并用乙醇定容至20 mL。取5 mL濾液，加入5 mL正己烷，渦旋混勻1 min，于4 ℃、9 500 r/min離心5 min，取1 mL下層清液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2.3 果蔬樣品

取1.000 g樣品加入10 mL 20%乙醇溶液，室溫超聲輔助提取30 min，于4 ℃、9 500 r/min離心10 min，上層清液過濾，收集濾液。殘渣用10 mL 20%乙醇溶液重復提取1 次，合并濾液，并用乙醇定容至20 mL。取1 mL濾液，過0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.2.4 空白實驗

除不加試樣外，均按上述步驟進行。

1.3.3 高效液相色譜-質譜條件

1.3.3.1 色譜條件

Waters Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；0.1%甲酸溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫，洗脫條件見表1；流速0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3.2 質譜條件

電離方式：電噴霧電離，正離子模式；噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：30 psi；霧化氣壓力：50 psi；輔助氣壓力：50 psi；掃描模式：多反應監測模式，15 種生物堿的質譜參數見表2。

表2 15 種生物堿的質譜參數Table 2 Mass spectrometric parameters for 15 alkaloids

1.4 方法的準確度和精密度

通過向陰性樣品中添加標準樣品，按相同的方法進行測定，外標法定量，驗證方法的回收率。分別向不同基質添加1、3、5倍定量限3個水平的標準樣品，每個水平5個平行，計算相對標準偏差。

1.5 方法的穩定性

在番茄陰性樣品中添加待測物，按照本方法處理后，在第0、4、8、12、16、20、24小時分別測定，代入標準曲線計算被測物質的濃度，并計算其相對標準偏差，考察被測物質在測試溶液中放置24 h內的穩定性（環境溫度25℃）。

1.6 基質效應評價

定量測定空白基質提取液配制的標準溶液與20%乙醇溶液中相同質量濃度待測物的離子響應強度，計算二者相對比值評價其基質效應：

式中：A和B分別為20%乙醇溶液配制的標準溶液與空白基質液配制的標準溶液峰面積。

2 結果與分析

2.1 質譜參數的優化結果

配制質量濃度為100 ng/mL的15 種生物堿的單標溶液，采用針泵注射的方式將標準溶液泵入質譜，優化質譜參數。生物堿大都含有雜環原子，在正離子模式下易得到一個H+形成準分子離子峰[M+H]+，所以實驗選用正離子模式。采用全掃描模式找到母離子，通過子離子掃描模式選擇響應較高的兩個碎片離子，對碰撞能、去簇電壓等參數進行優化。最終選定母離子與豐度較高，干擾較小的1 對特征子離子進行定性分析，選擇其中響應值高的作為定量離子。

2.2 色譜柱的選擇及分離條件的選擇結果

考察3 種色譜柱（Waters Xbridge BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；Thermo Accuore-150 C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）和資生堂Capcell PAK C18（2.1 mm×100 mm，2 μm））對15 種生物堿的分離效果。結果表明，使用Thermo C18柱時檳榔堿和毛果蕓香堿沒有基線分離，士的寧、馬錢子堿、阿托品也沒有基線分離；使用資生堂色譜柱時，15 種生物堿峰形良好，但峰面積普遍偏低；使用Waters C18時，15 種生物堿實現了基線分離，并且峰形良好，峰響應也有所提高，因此選擇Waters Xbridge BEH C18柱。

本研究對比了甲醇-水體系、甲醇-0.1%甲酸溶液體系、乙腈-水體系、乙腈-0.1%甲酸溶液體系作為流動相時15 種生物堿的色譜行為和質譜響應。結果表明，流動相中含有0.1%甲酸溶液時，儀器信號響應明顯高，因此選擇含0.1%甲酸溶液的體系；有機相為乙腈時，色譜柱的柱壓比有機相為甲醇時低，并且有機相為乙腈時分析物的峰形相對更好。因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

為實現15 種生物堿的基線分離，考察不同梯度條件下的分離情況。C18柱對毛果蕓香堿幾乎沒有保留，不同梯度條件下毛果蕓香堿的保留時間變化不大。檳榔堿和毛果蕓香堿、士的寧、馬錢子堿、阿托品的出峰時間比較接近，為實現基線分離，需要比較平緩的梯度；次烏頭堿、烏頭堿結構類似，保留時間也比較接近。通過改變梯度洗脫條件，最終實現了15 種生物堿的基線分離，最終優化的梯度洗脫條件見表1。在優化好的洗脫條件下，分離情況最差的檳榔堿和毛果蕓香堿的分離度達1.8，能滿足定量分析要求。玉米基質中15 種生物堿的總離子流圖（添加量100 μg/kg）見圖1。

圖1 玉米基質中15 種生物堿的總離子流圖（添加量100 μg/kg）Fig. 1 Total ion chromatogram of 15 alkaloids in corn samples at spiked level of 100 μg/kg

2.3 試樣前處理條件的選擇和優化結果

2.3.1 提取溶劑的選擇

文獻[31]報道采用酸性溶液振蕩，超聲提取后用三氯甲烷萃取測定藥材中二萜類生物堿，另外根據大部分生物堿難溶或微溶于水、易溶于有機溶劑的特點選擇常用的甲醇和乙醇、乙腈有機溶劑，考察三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈4 種有機溶劑的提取效果。通過標品添加方式考察不同提取溶劑時分析物的回收率最終確定20%乙醇溶液為后續實驗的提取溶劑。

2.3.2 凈化方法的考察

由于食品基質復雜，形態多樣，為降低基質效應的影響采用固相萃取柱對目標物進行凈化。選擇玉米粉為基質，15 種生物堿添加量為100 μg/kg，考察陽離子交換柱的凈化效果。

經陽離子交換柱后，秋水仙堿、鬼臼毒素沒有檢測到，表明陽離子交換柱不適合這兩種物質；毛果蕓香堿、茄堿，回收率分別為2.9%和64.5%；馬錢子堿的回收率為75.6%，其他10 種生物堿的回收率在86.3%～110.7%之間。

后續選擇番茄、雪梨汁加標樣品經陽離子交換柱后進行測定，結果與玉米粉類似。因此，該前處理過程沒有采用陽離子固相萃取柱凈化。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

用20%乙醇溶液配制質量濃度分別為1、2、5、10、20、50 ng/mL和100 ng/mL的系列標準工作溶液，按照質量濃度由低到高依次進行測定。以分析物質量濃度為橫坐標，以分析物定量離子對的質譜響應值為縱坐標，擬合曲線，得到線性回歸方程，15 種化合物的相關系數均高于0.99。阿托品的線性范圍為0.5～100 μg/L，次烏頭堿、新烏頭堿的線性范圍為1～100 μg/L，東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿的線性范圍為2～100 μg/L，麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿的線性范圍為4～100 μg/L。采用加標回收的方法確定方法的檢出限和定量限，分別以3、10 倍信噪比為方法的檢出限和定量限。各生物堿的線性范圍、相關系數、回歸方程、檢出限和定量限見表3。阿托品的檢出限為4 μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為6 μg/kg，東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿為10 μg/kg，麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿為20 μg/kg。阿托品的定量限為10 μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為20 μg/kg，東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿為40 μg/kg，麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿為80 μg/kg。

表3 15 種生物堿的標準曲線及相關參數Table 3 Standard curve equations, LODs and LOQs for 15 alkaloids

2.5 方法的準確度和精密度實驗結果

表4 方法回收率Table 4 Recoveries of the method

續表4

由表4可知，生物堿在植物源性飲料中回收率為83.1%～119.8%，相對標準偏差為0.05%～9.81%；糧谷類食品中回收率為82.4%～119.4%，相對標準偏差為0.06%～9.86%；果蔬類食品中回收率為80.9%～118.4%，相對標準偏差為0.01%～9.9%，均滿足標準檢測方法的要求。

2.6 穩定性實驗結果

表5 日內穩定性Table 5 Intra-day stability

日內穩定性測定結果見表5，相對標準偏差為2.78%～5.21%，符合檢測要求。

2.7 基質效應的評價結果

15 種生物堿質量濃度為20 μg/L，平行測定3 次。結果顯示，各分析物的平均基質效應為17.5%～117.7%。評價結果見表6，阿托品、東莨菪堿、檳榔堿、士的寧、鉤吻堿基質效應比較明顯，實際樣品檢測時如檢出該類物質，應該用陰性基質提取液配制的標準溶液定量。

表6 基質效應Table 6 Matrix effect %

2.8 樣品檢測結果

使用本研究建立的分析方法，對典型植物源飲料、糧谷食品和果蔬等15 個樣品進行了檢測，其中鍋巴和薯片樣品中有茄堿檢出，檢出含量分別為800.4 μg/kg和100.3 μg/kg，其他生物堿均未檢出。

3 結 論

本實驗建立了食品中15 種有毒生物堿的高效液相色譜-串聯質譜法，研究和優化提取條件、凈化方式、色譜-質譜參數等指標，對方法的檢出限、線性范圍、回收率、精密度、基質效應進行評價和驗證。經實際樣品測定表明建立的高效液相色譜-串聯質譜方法適用于植物源飲料、糧谷食品和果蔬等樣品中15 種生物堿的檢測。與賀琦等[3]建立的食品（紅酒、牛奶、面包、米粉）中20 種有害生物堿含量測定的液相色譜-質譜法相比，本方法的適用范圍更廣，對糧谷類玉米粉、面粉、鍋巴和薯片，果蔬類番茄、茄子、桃和土豆，植物源飲料類山楂汁、雪梨汁、芒果汁和王老吉等樣品進行驗證，并且前處理過程簡單、快速，適用于主要食品中15 種有毒生物堿的快速篩查分析。本方法的建立為相關監測機構提供技術支撐，有利于保障消費者健康。