蛋白質組學及其研究技術概述

劉 偉 劉書廣 韓留福

(河北師范大學生命科學學院 石家莊 050024)

人類基因組計劃的完成，使人類向“了解自己的生命奧秘”這一目標邁進了一大步。蛋白質是基因功能活動的最終執行者，是生命現象復雜性和多變性的直接體現者。因此，要揭示整個生命活動的規律，就必須研究基因的產物——蛋白質，從基因水平向蛋白質水平的擴展成為了生命科學發展的重要趨勢。蛋白質在合成之后具有相對獨立的修飾、轉運和相互間作用的能力，同時還具有對外界因素發生反應的能力[1]。因此，只有從蛋白質組學的角度對所有蛋白質的總和進行研究(即開展蛋白質組學研究)，才能更加貼近生命現象的本質，認識生命活動的規律[2]。

1 蛋白質組學簡介

蛋白質組(proteome)的概念由澳大利亞學者Wilkins和Willian于1994年提出,指由一個基因組(genome)或一個細胞或組織表達的所有蛋白質，也可以指細胞或組織、機體全部蛋白質的存在及活動方式。蛋白質組學旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式。從定義上可以清楚地看出，蛋白質組學不同于傳統的蛋白質學科之處在于： 它的研究是在生物體或其細胞的整體蛋白質水平上進行的，它試圖從一個機體或一個細胞的蛋白質整體活動的角度來闡明生命活動的基本規律。

蛋白質組學的研究內容包括兩個方面： ①對蛋白質表達模式的研究，涉及對蛋白質組組成的分析鑒定，是蛋白質組學研究的主要內容，它要求對蛋白質組進行表征，即實現亞細胞結構、細胞或組織等不同生命結構層次中所有蛋白質的分離、鑒定及圖譜化，以及比較、分析在發展變化的生理條件下蛋白質組所發生的變化；②對蛋白質組功能模式的研究，即通過各種技術(如用以建立蛋白質組各組分的相互作用關系的網絡圖的大規模酵母雙雜交技術，以及雙向電泳、質譜鑒定和生物信息學等蛋白質組學研究技術)分析蛋白質之間的相互作用，揭示蛋白質的功能。

2 蛋白質組學相關技術

2.1 樣品制備技術 激光捕獲顯微切割技術(laser capture microdissection， LCM)是組織水平上蛋白質組樣品制備的一大突破。LCM是在不破壞組織結構、保存要捕獲的細胞和其周圍組織形態完整的前提下，直接從冰凍或石蠟包埋組織切片中獲取目標細胞，成功地解決了組織中的細胞異質性問題，從而可以進行純細胞的蛋白質組研究。其原理是： 用乙烯醋酸鹽聚合體覆蓋在被選擇的細胞上，然后用紅外激光照射使膜短暫熔化，這時膜與組織在目標位置牢固結合。當膜被提起時，靶細胞便隨同膜一起由切片中分離出來。直接在膜上裂解細胞，再進行分離及蛋白質組分析。該技術由Emmert Buck等人于1996年發明[3]，1997年美國Arcturus Engineering Inc將其標準化，并發展成商業化的自動化操作系統，是目前較為理想的細胞提取工具。

2.2 蛋白質分離技術 主要包括雙向凝膠電泳、高效液相色譜和毛細管電泳技術。

2.2.1 雙向凝膠電泳 蛋白質分離目前首選二維凝膠電泳(two-dimensional gel-electrophoresis， 2-DE)，它作為一種比較成熟的技術已被廣泛應用了20余年，也是目前對蛋白質組分辨率最高、重復性最好的分離技術[4]。二維凝膠電泳的基本原理是： 根據蛋白質的等電點和分子量大小不同，進行兩次電泳將其分離。由于2-DE利用了蛋白質兩個彼此不相關的重要性質對其進行分離，因此分辨率非常高，一般能分辨到1000～3000個蛋白質點。二維電泳分離后的蛋白質點需經染色顯示出來。常用的顯色方法有： 考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色或同位素標記等。

2.2.2 高效液相色譜 高效液相色譜(high perfor-mance liquid chromatography, HPLC)基于樣品分子在固定相和流動相之間的特殊相互作用而實現樣品的分離。無須變性處理樣品，可實現上樣、收集、在線分析的自動化。常用于相對分子量小于1×103的蛋白質、膜蛋白及低豐度蛋白質的分離。

2.2.3 毛細管電泳 毛細管電泳(capillary electrop-horesis, CE)技術是指在高電場強度作用下，對毛細管中的樣品按分子質量、電荷、電泳遷移率等差異進行有效分離，包括毛細管區帶電泳、毛細管等電聚焦和篩板-SDS毛細管電泳等技術。其優點是可實現在線自動分析，可用于相對分子質量范圍不適于2-DE的樣品，缺點是存在對復雜樣品分離不完全的現象[5]。

2.3 雙向凝膠電泳的染色技術 蛋白質經分離后，需要用一定的技術將其顯現出來，之后才能對其進行分析。目前有許多方法可以檢測雙向凝膠上分離的蛋白質，最普通的是用染料或銀離子對蛋白質進行染色。下面介紹4種常用的染色方法。

2.3.1 銀染法 銀染法具有很高的檢測靈敏度，可檢出2～4ng的蛋白點。Sinha等[6, 7]對銀染法進行了重要改進，使之與質譜技術有了匹配度，大大提高了銀染法在蛋白質組學中的應用。

2.3.2 熒光染色法 利用熒光染料(如SYPRO Ruby等)對凝膠進行染色，其靈敏度與銀染法相似，具有幾乎700倍于銀染的線性變化范圍，并且在多種分析軟件上可以看到精確量變，也不存在與質譜的匹配度問題。

2.3.3 膠體考馬斯亮藍染色 利用考馬斯亮藍R250和G250等染料與蛋白質結合能力較強、與凝膠結合能力較差的原理對凝膠進行染色，經過脫色等步驟使蛋白質和凝膠的著色出現較大的反差，使蛋白質點顯現。該方法檢測靈敏度為8～50ng/蛋白點，雖然靈敏度低，但因其操作簡單且與質譜匹配度好，因而一直被廣泛應用。

2.3.4 磷蛋白染色 因蛋白質的磷酸化狀態是其功能的關鍵狀態，磷蛋白染色變得日益重要[8]。蛋白質在2-DE膠上量變的可視化是比較蛋白質組分析的重中之重。銀染有較高的靈敏度但線性變化范圍較小，而考馬斯亮藍染色又缺少靈敏度。一些研究者先用熒光染料，再用考馬斯亮藍法染色的復染法來達到靈敏地檢測蛋白量變的可視化。

為了使凝膠上的蛋白質點能夠被充分檢測，放射自顯影技術也被應用于雙向凝膠成像[9, 10]。

2.4 蛋白質鑒定技術 主要介紹質譜技術和多維蛋白質鑒定技術。

2.4.1 質譜技術 質譜(mass-spectrometric technique)能夠產生并分離分子和離子，并根據其質量與電荷的比值進行檢測[11]。因產生離子的方法不同而發展起來的質譜包括基質輔助激光光解吸附離子化質譜、電噴霧離子化質譜以及表面增強激光解析離子化質譜。

2.4.2 多維蛋白質鑒定技術 多維蛋白質鑒定技術(multidimensional protein identification technology, Mud-PIT)是指將總蛋白混合物通過消化得到各種肽段，上樣于強陽離子交換柱，然后不連續梯度洗脫到反向色譜柱上，再用具備梯度洗脫能力的洗脫液洗脫反向色譜柱，對洗脫液直接用質譜進行解析。

2.5 蛋白質間的相關作用分析技術 主要介紹酵母雙雜交系統和表面等離子共振技術。

2.5.1 酵母雙雜交系統 自Fields和Song[12]建立酵母雙雜交系統(yeast two hybrid system)以來，該法已經成為分析蛋白質間相互作用的強有力的方法。它可用來在體內檢驗蛋白質間、蛋白質與小分子肽、蛋白質與DNA、蛋白質與RNA間的相互作用，還能用來發現新的功能蛋白質和研究蛋白質的功能。酵母雙雜交技術只能反映蛋白質間可能發生作用，還必須結合其他試驗才能確認，尤其是要與生理功能研究結合。即使如此，該項技術在蛋白質間的相互作用、篩選新的蛋白質以及研究蛋白質功能等方面仍發揮著重要的作用。

2.5.2 表面等離子共振技術 表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)技術已成為當今一種全新的研究蛋白質之間相互作用的手段。表面等離子體共振SPR生物傳感器是利用表面等離子體共振現象和SPR譜峰對金屬表面上電介質變化敏感的特點，通過將受體蛋白固定在金屬膜上，檢測受體蛋白與液相中配體蛋白的特異性結合。SPR技術的特點是測定快速、安全、不需標記物或染料、靈敏度高。除了應用于檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用外，還可以檢測蛋白質與核酸或其他生物大分子之間的相互作用，并能對整個反應過程進行實時監測。

2.6 生物信息學分析 生物信息學(bioinformatics)是在生命科學、計算機科學和數學的基礎上逐步發展而形成的一門新興交叉學科，是以理解各種數據的生物學意義為目的，運用數學與計算機科學手段進行生物信息的收集、加工、存儲、傳播、分析與解析的科學[13]。生物信息學在基因組學和蛋白質組學的研究中起著特殊的重要作用，因為基因組和蛋白質組研究提供的數據數量之大在生物學史上是史無前例的。當前，生物信息學不但可以高效地進行基因組和蛋白質組數據的分析，而且還可以對已知或新的基因產物進行全面的功能分析。例如，用生物信息學對質譜得到的肽指紋圖譜(peptide-mass fingerprinting)的分析獲得了一個新的在進化過程中保守的模序(motif)，它對蛋白質的結構和功能具有重要意義。雖然產生在計算機技術基礎上的生物信息還存在著計算方法的局限性和自動推理的不完善性，使通過計算機所獲得的生物知識還不可能完全視為規律，而有待回到真實的細胞組織內進行驗證，但可以肯定的是，隨著生物信息學成為后基因組的中心主題，蛋白質信息學也將成為蛋白質組學中最有活力的新領域。

3 展望

當前，雖然蛋白質組研究還處于初期發展階段，相關技術手段及其配套應用還很不成熟，但是其受重視的程度和進展還是顯著的。我國于1997年設立了重大項目“蛋白質組學技術體系的建立”，1999年由中國科學院上海生化研究所等多家單位聯合組成課題組，啟動了國家重點基礎研究發展規劃項目“人類重大疾病的蛋白質組學研究”，2001年，由北京9家高校、科研單位聯合組建成立了蛋白質組學研究院，其研究的主要對象之一就是嚴重威脅我國人口健康的肝病。從蛋白質組學這個研究領域誕生以來，基礎研究和實際應用的期望就表現出強烈結合的趨勢。

隨著蛋白質鑒定技術的發展和生物信息學技術的應用，將會有更多的新蛋白得到分離鑒定，從而得到更多與疾病相關的分子標記物，也能為相關藥物研究提供更多候選靶標。

(*通信作者)