藥品微生物控制中水分活度測定的應用前景*

楊曉莉，李 輝 ，許華玉 ，王似錦，繩金房

（1．陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065； 2．國家藥典委員會，北京 100061；3．中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

水分活度(aw）是評價食品和化妝品微生物風險和產品穩定性的重要依據，但在制藥工業中使用水分含量反映藥品質量安全和穩定還是一個相對較新的概念[1]。aw與微生物的生長密切相關，而微生物指標是反映藥品安全性和有效性的重要指標，通過測定aw可更好地反映藥品質量[2]。2015年版《中國藥典》整合了先進理念，借鑒了國外藥典的先進技術和經驗，兼顧國情對非無菌制劑微生物限度檢查法等內容做了較大修訂[3]，但在非無菌制劑微生物控制相關指導原則方面還不完善，僅收載了水分測定方法[4]，尚未收載aw測定在非無菌制劑中的應用指導原則，仍與《美國藥典》(USP）存在一定差距[5]，這一現狀與我國《藥品生產質量管理規范》（GMP）強調的藥品源頭控制和過程控制要求不相適應[6]。因此，亟需制訂相應的指導原則，以提高藥品微生物污染的源頭控制和過程控制的可操作性和有效性。

1 概述

1953年，澳大利亞食品微生物學家Scott[7]研究了30℃下金黃葡萄球菌與aw的關系，發現其生長有最低的aw限值，低于該值微生物就不能生長，首次提出了aw的概念[7]。隨后，Christian等[8]研究沙門菌的生長與aw的關系，發現了類似規律。1957年，Scott[9]對引起食品腐敗的微生物與aw的關系進行了全面論述，發現是aw而不是水分含量決定微生物賴以生存的自由水的多少。之后，aw與微生物的關系便成為微生物科學家研究的熱門領域[10-13]。1978年，德國食品微生物學家L．Leistner研究了影響微生物生長的各種因素，提出了柵欄理論，認為aw是影響微生物生長的重要柵欄因子之一，aw與其他柵欄因子協同作用，應用于食品的保存[14]。2006 年，USP 29-NF24<1112>首次收載aw測定[15]應用于非無菌制劑微生物控制的章節，將其成功引入制藥工業藥品微生物控制[15]。

aw是相同溫度下產品水蒸氣壓(P）與純水蒸氣壓(Po）的比值。其在數值上等于封閉系統中由產品產生的相對濕度（RH）的1/100。RH可通過直接測量蒸氣分壓或露點的方法獲得，也可通過傳感器間接測量[5]。aw和平衡相對濕度（ERH）的計算關系為ERH(%）=aw×100%。

2 水分活度與微生物控制原理

2.1 微生物生長的最低 aw

微生物生長環境中可利用的水分是其生長的必要條件，而aw表示產品中水的一種能量狀態[16]，反映水與產品組分之間結合的緊密程度，是微生物賴以生存的自由水的量度。aw介于0～1。數值越大，表示水的自由程度越高，越容易被微生物利用；數值越小，表示水的自由程度越低，水與產品組分之間結合得越緊密越難被微生物利用。aw與微生物的生長密切相關，在控制微生物生長繁殖方面起著重要作用。

通常物質中的水被分為自由水（或游離水）和結合水。微生物需要自由水進行新陳代謝活動，如細菌細胞只能通過細胞壁傳遞營養物質和代謝產物，代謝產物必須是可溶形式以滲透細胞壁[17]。當微生物細胞處于低aw時，由于滲透作用，水傾向于流出細胞，如果細胞無法調節水的平衡，細胞生長將會被抑制甚至死亡[18]。而aw是“自由水”的量度，因此用于反映微生物的生長繁殖，aw是比水分含量更有效的參數。微生物的生長活動只發生在一定aw范圍內，其生長都有最低限值，低于了這個限值微生物就不能生長。不同微生物生長的最低aw需求不同。一般來說，革蘭陰性菌包括與藥品質量密切相關的控制菌，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌等在aw低于0．91的產品中不會生長繁殖，革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌在aw低于0．86不會生長繁殖，黑曲霉在aw0．77以下不會生長繁殖，所有微生物在aw低于 0．60時不會增殖[5]。

產品中的aw降低意味著微生物可利用的自由水減少，微生物的新陳代謝困難。許多微生物通過細胞調節可在低aw條件下存活，但不能生長。隨著aw的降低將導致微生物生長停滯期的延長，生長速率減慢和菌落數量減少[16]，圖1顯示了不同aw對金黃色葡萄球菌生長曲線和最大菌落數量的影響[19]。產品中細菌、酵母菌和霉菌的萌發、新陳代謝、繁殖和生存需要可利用水，基于這樣的規律，可利用aw這一重要參數預測產品中潛在微生物生長繁殖的能力和潛在的安全風險。

圖1 不同 aw對金黃色葡萄球菌生長曲線和最大菌落數量的影響

2.2 aw是微生物生長的柵欄因子

aw的研究源于食品，在食品中的應用也較為成熟。柵欄技術認為aw是諸多影響微生物生長的重要柵欄因子之一。柵欄技術把高溫、低溫、控制aw、調節pH、采用輻照、控制氧化-還原電位、添加抑菌劑等歸納成單獨柵欄因子，并提出食品防腐就是調控這些因子，打破微生物內平衡，從而限制微生物的生長繁殖[14]。這些因子相互作用形成了特殊的防止食品腐敗變質的柵欄，對食品的防腐保持聯合作用及柵欄效應。柵欄因子間的相互作用及與食品中微生物的相互作用的結果，不僅是這些因子單獨效應的簡單累加，而且也是協同作用，這種效應稱作柵欄效應（hurdle effect）[20-21]。控制aw，對于中等含水量和高含水量食品保藏具有重大意義。在食品儲藏中，初始載荷微生物應當不能克服最初的柵欄因子，否則食品就會腐敗變質，甚至引發食物中毒。通過柵欄技術使食品本身具有一定的抑菌能力，可以使食品的微生物特性穩定，使得儲藏的食品更安全[22]。

柵欄技術應用于食品保存的6個案例[23]（圖2）可幫助理解aw對于微生物生長的重要意義。柵欄因子的組合將增加不利于食品中潛在微生物的生長，并增加微生物生長的滯后期，如果微生物的生存環境持續抑制其生長繁殖，滯后期無限延長，將致使微生物死亡[24]。

圖2 6個食品保存案例柵欄效應分析

3 aw在藥品微生物控制中的應用現狀

相比藥品，食品中富含豐富的營養成分，更適合微生物的生長繁殖，aw在食品工業中的成功應用，為非無菌制劑的微生物控制提供了值得借鑒的新方法。USP<1112>中提到的“水分活度的測定在非無菌制劑中的應用”，為非無菌制劑的微生物控制提供了一個有力的應用指導原則。相比微生物限度檢查，aw測定可以更快[25]、更準確地預測微生物對產品穩定性和安全性的影響。同時，aw也和產品的化學和物理穩定性有直接關系。通過對藥品aw的測定和分析，不但可篩選出更合理的處方，同時還能預測藥品潛在的微生物風險。

然而，aw測定在藥品微生物控制中的應用還是一個較新的領域，通過其可以反映藥品潛在微生物生長狀況及評估安全風險，近年來逐漸受到重視。一些制藥公司已利用aw控制微生物生長的理念開發新藥，可節省成本，優化微生物限度檢查方案。如美國輝瑞制藥有限公司應用aw預測生產過程中溶液中微生物的生長或抑制，創建溶液類型，以確定溶液的有效期，節省時間-費用成本[26]。葛蘭素史克公司在新藥開發時，將aw作為穩定性計劃的一部分進行測試，以確保包裝產品在特定儲存溫度和濕度下的質量穩定，滿足安全性標準和有效期要求[27]，為研發和商業應用提供優化的微生物限度檢查和抑菌效力檢查測試計劃節省大量資源和成本，提高了效率[28]。

目前，制藥企業存在對藥品過度防護和依賴終端檢驗的情況，微生物污染風險管理水平較薄弱，過程控制手段缺失。aw是影響微生物生長的關鍵因素，影響著藥品的安全性和有效性，對其測定是進行藥品生產的過程控制和參數放行的必要手段，值得深入研究和應用。

4 aw在藥品微生物控制中的應用前景

在制藥工業中，非無菌制劑aw與以下方面有關：1）藥品處方及抑菌體系的抑菌有效性；2）藥品處方中易于化學水解的活性藥物成分的降解；3）藥品處方(尤其是液體、膏、乳液和霜）易受微生物污染的程度；4）提供了減少微生物限度檢查，依照通則非無菌制劑微生物限度檢查法篩查藥品有效性、穩定性和控制菌釋放的理論依據[5]。不同aw藥品中的微生物生存行為對于藥品微生物控制非常重要，低aw會防止微生物在藥品上的生長繁殖。在科學的微生物風險評估基礎上，可根據aw設置有針對性的個性化微生物控制方案，如全面的微生物限度檢查或減少日常檢查。應注意的是，使用aw進行微生物控制，必須遵循嚴格的GMP，以確保微生物的最低負荷。USP<1112>提供了藥品處方對微生物污染影響的指導，降低藥品aw對預防潛在微生物的增殖大有裨益；非無菌制劑的處方，生產步驟和測試應反映這一參數。

當前符合GMP生產要求的藥品aw較低，沒有或幾乎沒有微生物污染的風險，在此情況下，日常進行的微生物限度檢查沒有必要。由于非水性液體制劑或固體藥劑為低aw，不支持孢子萌發和微生物生長，其微生物監控頻率決定于產品的歷史測試數據和原料、水、生產過程的微生物污染控制的有效性證明[28]。在科學的微生物風險評估基礎上，采用aw測定進行微生物監控，建立合理的微生物控制策略、設計性能優良的藥品對于節約成本、提高效率、提升產品質量具有重要指導意義。

國際人用藥品標準協調組織（ICH）Q6A的決策樹6#原料藥和輔料的微生物檢查（圖3）和8#非無菌藥品的微生物檢查（圖4）[29-30]，是低aw的非無菌原料藥和輔料及非無菌制劑可不進行批批微生物限度檢查的重要技術指導原則[28]。我國于2017年正式加入ICH，意味著中國的藥品監管部門、制藥行業和研發機構將逐步轉化和實施國際科學技術標準和指南，并積極參與規則制訂，將推動國際創新藥品早日進入中國市場，滿足臨床用藥需求，同時提升國內制藥產業創新能力和國際競爭力[31]。在新形勢下研究國外藥品微生物控制方面的先進經驗，對于優化產業升級、節約資源及逐步提高我國藥品的國際競爭力具有現實意義。應用aw控制藥品生產過程的微生物生長是微生物控制發展的必然趨勢。應重視aw在藥品研發階段參與處方篩選，評估藥品的微生物風險，設計出低微生物風險的藥品，不是依賴檢驗進行藥品的微生物控制，而是質量源于設計（QbD）理念的必然要求。然而，我國藥品領域尚未建立aw測定的標準方法，利用aw控制微生物生長的應用仍為空白。因此，亟待制訂符合國情和發展需要的非無菌制劑aw的測定應用指導原則，以推動我國藥品微生物控制的發展。

圖3 ICH Q6A決策樹6#（原料藥和輔料的微生物檢查）

圖4 ICH Q6A決策樹8#（非無菌藥品的微生物檢查）