姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖凋亡和侵襲能力的影響

陳永宏，高 月

（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶 400700）

非小細(xì)胞肺癌是我國(guó)發(fā)病率和致死率最高的腫瘤性疾病，高度的侵襲性是其致死率高、復(fù)發(fā)率高的主要原因。目前，抗腫瘤藥物的作用機(jī)制大多數(shù)都是以提高腫瘤細(xì)胞凋亡率，降低腫瘤細(xì)胞增殖能力和侵襲能力為主。有研究提出，某些藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的上述一個(gè)特性或多個(gè)特性存在著影響作用。姜黃素是從姜黃根莖中提取出來(lái)的酚類化合物，具有抗炎、抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力[1]。本研究中探討了姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲功能的影響機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：722n型分光光度計(jì)（上海菁華科學(xué)儀器有限公司）；acea novocyte型流式細(xì)胞分析儀（艾森生物有限公司）；奧林巴斯cx23型光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社）；genosens1850型凝膠成像儀（上海勤翔凝膠科學(xué)儀器有限公司）。

試藥：姜黃素（上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)B10359-25g）；二甲基亞砜（上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào) A5852）；小牛血清（批號(hào) HLC1401），1640 培養(yǎng)基（批號(hào)HLC150120）均購(gòu)于上海哈林生物科技有限公司。四甲基偶氮唑鹽溶液(批號(hào)M2003）；DMSO溶液(批號(hào) D2650）；胰酶(批號(hào) T4674）；binding buffer，Annexin-FITC，Propidum Iodide細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)APOAC-1KT）均購(gòu)于Sigma公司。P27單克隆抗體 (批號(hào) P2092），Orai1 單克隆抗體(批號(hào) O8264），Caspase-3單克隆抗體 (批號(hào)c8487），EGFR單克隆抗體(批號(hào)SAB4300352），STIM1 單克隆抗體(批號(hào) S6197），E-cadherin單克隆抗體(批號(hào)U3254），MMP-9單克隆抗體(批號(hào) SAB4501896），GAPDH單克隆抗體(批號(hào)G9295）均購(gòu)于Sigma公司。

細(xì)胞：非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞由西南醫(yī)院呼吸內(nèi)科贈(zèng)送。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)方法：將對(duì)數(shù)期非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞用含有7%小牛血清的1640培養(yǎng)基，按1∶5的比例在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)[2]。

姜黃素溶液配置方法：將5．90 mg姜黃素用200 μL二甲基亞砜溶解，再加入7 800 μL無(wú)血清1640培養(yǎng)基配制成質(zhì)量濃度為2 000 μmol/L的姜黃素溶液原液[3]。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：將細(xì)胞濃度調(diào)整為50 000個(gè)/mL后，按150mL/孔加入96孔板，在37℃及5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，吸出上清液，分別于低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)孔中分別加入姜黃素溶液(姜黃素質(zhì)量濃度分別為 10，20，40 μmol/L）和培養(yǎng)基，調(diào)整各孔體積為150 μL，對(duì)照組則只加入等體積的培養(yǎng)基。在上述環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，再培養(yǎng)4 h，吸出各孔上清液，加入DMSO溶液150 μL，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值）/對(duì)照組吸光值[4-5]。

流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：將各組細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL的細(xì)胞分別在不含姜黃素的培養(yǎng)基和姜黃素質(zhì)量濃度為10，20，40 μmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，爾后用胰酶消化，洗滌，然后用binding buffer細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒重懸，加入Annexin-FITC和Propidum Iodide細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒孵育0．5 h，最后使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)樣本[6]。

Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：將對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞分別用不含姜黃素的培養(yǎng)基和含姜黃素質(zhì)量濃度為10，20，40 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，離心重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL，將用50 mg/L的 matrigel 1∶8稀釋液濕潤(rùn)后的transwell小室風(fēng)干，然后每個(gè)小室加入200 μL F-12培養(yǎng)基，分別加入培養(yǎng)后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL，將小室放在24孔板上（每孔內(nèi)含F(xiàn)-12培養(yǎng)基 200 μL），在 37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng) 24 h。將 24 孔板內(nèi)加入4%多聚甲醛1 mL，再放入小室，固定20 min，然后風(fēng)干，染色，在顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。侵襲抑制率 =（1-各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù) /對(duì)照組細(xì)胞數(shù)）×100%[7]。

Western Blotting法檢測(cè)增殖凋亡相關(guān)蛋白和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：將對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞分別用不含姜黃素的培養(yǎng)基、含姜黃素濃度為 10，20，40 μmol/L 的培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè) /mL，放入 12孔板中，在 37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h。提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白，最后制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，然后分別用P27，Orai1，Caspase-3，EGFR，STIM1，E-cadherin，MMP-9，GAPDH兔抗人單克隆蛋白在37℃條件下對(duì)上述樣品進(jìn)行封閉，最后按說(shuō)明書(shū)加入二抗結(jié)合，洗滌，成像[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示，用t檢驗(yàn)。P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖凋亡情況

由表1可知，對(duì)照組細(xì)胞吸光度顯著高于低劑量組，低劑量組顯著高于中劑量組，中劑量組顯著高于高劑量組（P<0．05）；而增殖抑制系數(shù)和凋亡率對(duì)照組顯著低于低劑量組，低劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于高劑量組（P<0．05）。說(shuō)明姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖能力有抑制作用，同時(shí)還有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且與姜黃素存在劑量依賴關(guān)系。

表1 各組細(xì)胞增殖凋亡能力檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 各組細(xì)胞增殖凋亡能力檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP<0．05；與低劑量組相比，bP<0．05；與中劑量組相比，cP<0．05。下表同。

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組吸光度0．853 ±0．021 0．752 ±0．015a 0．674 ±0．014ab 0．537 ±0．011abc增殖抑制系數(shù)（%）0 11．84 ±0．98a 20．98 ±1．24ab 37．05 ±2．23abc凋亡率（%）4．17 ± 0．87 9．83 ± 0．92a 15．76 ± 1．01ab 25．87 ± 1．22abc

2.2 細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

由表2可知，P27和Caspase-3蛋白的表達(dá)量，對(duì)照組顯著低于低劑量組，低劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于高劑量組（P<0．05）。EGFR，Orai1，STIM1蛋白表達(dá)，對(duì)照組顯著高于低劑量組，低劑量組顯著高于中劑量組，中劑量組顯著高于高劑量組（P<0．05）。說(shuō)明姜黃素可有效影響細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，且存在劑量依賴關(guān)系。

表2 各組細(xì)胞增殖和凋亡能力相關(guān)蛋白表達(dá)情況( ± s）

表2 各組細(xì)胞增殖和凋亡能力相關(guān)蛋白表達(dá)情況( ± s）

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組P27/GAPDH 1．01±0．05 1．83±0．07a 3．72±0．10ab 5．56±0．11abcOrai1/GAPDH 1．04±0．02 0．92±0．03a 0．76±0．04ab 0．53±0．02abc Caspase-3/GAPDH 67．2±7．5 110．6±9．3a 154．9±10．4ab 193．7±11．2abc EGFR/GAPDH 5．79±0．10 3．75±0．93a 2．51±0．89ab 1．42±0．78abc ST1M1/GAPDH 1．02±0．09 0．84±0．05a 0．68±0．03ab 0．48±0．02abc

2.3 細(xì)胞侵襲能力及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)情況

由表3可知，視野細(xì)胞數(shù)和MMP-9蛋白的表達(dá)量對(duì)照組顯著高于低劑量組，低劑量組顯著高于中劑量組，中劑量組顯著高于高劑量組（P<0．05）；侵襲抑制率和E-cadherin表達(dá)量，對(duì)照組顯著低于低劑量組，低劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于高劑量組（P<0．05）。說(shuō)明姜黃素有抑制A549細(xì)胞侵襲的作用，且存在劑量依賴關(guān)系。

表3 各組細(xì)胞侵襲能力及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果(±s）

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組視野細(xì)胞數(shù)124．56 ±3．67 83．24 ±3．23a 67．48 ±3．01ab 40．76 ±2．01abc侵襲抑制率（%）0 33．17 ±2．43a 45．83 ±3．43ab 67．28 ±4．24abc E-cadherin/GAPDH 0．612 ± 0．026 0．723 ± 0．023a 0．806 ± 0．017ab 0．902 ± 0．018abc MMP-9/GAPDH 0．792 ±0．019 0．685 ±0．018a 0．579 ±0．013ab 0．421 ±0．011abc

3 討論

P27和EGFR是2個(gè)與細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白[9]。EGFR可啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)周期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，與多種腫瘤細(xì)胞的增殖存在關(guān)聯(lián)[10]。非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞在接受姜黃素干預(yù)后，EGFR蛋白的含量較未接受干預(yù)的對(duì)照組細(xì)胞相比下降明顯，且這種下降幅度還與姜黃素的劑量呈顯著相關(guān)性。P27是一種可抑制細(xì)胞分裂和調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白[11]，姜黃素可有效提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)該蛋白的表達(dá)，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的作用，且這種作用與姜黃素存在著顯著的劑量依賴關(guān)系?？烧J(rèn)為姜黃素是通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR的表達(dá)和提高P27蛋白表達(dá)的方式來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

STIM1和Orai1是鈣池操縱的鈣離子通道（SOC）家族中十分重要的2種關(guān)鍵分子，其表達(dá)量的變化直接導(dǎo)致細(xì)胞的炎癥、凋亡和基因轉(zhuǎn)錄變化[12]。姜黃素可有效降低上述2種蛋白表達(dá)量下降，且該效應(yīng)與姜黃素劑量存在相關(guān)性。Caspase-3是Caspase家族中重要的關(guān)鍵分子，是該家族誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子[13]，姜黃素可有效誘導(dǎo)該分子，且該作用還與姜黃素的劑量存在相關(guān)性。因此，可推測(cè)姜黃素是通過(guò)上調(diào)腫瘤細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)，抑制STIM1和Orai1表達(dá)，從而起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

姜黃素可有效降低腫瘤細(xì)胞侵襲性，這種抑制作用也與姜黃素存在劑量依賴關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效降低MMP-9的表達(dá)量，提高E-cadherin的表達(dá)量，且這種變化也與姜黃素存在劑量依賴關(guān)系。E-cadherin是介導(dǎo)細(xì)胞互相黏附的跨膜蛋白，其表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間互相黏附松散導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移概率增大，姜黃素可有效上調(diào)腫瘤細(xì)胞中該蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞間的黏附力，降低其侵襲性。同時(shí)，MMP-9能降解細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了很大作用，姜黃素可有效降低該蛋白的表達(dá)量，降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[14]。認(rèn)為姜黃素抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制就是降低腫瘤細(xì)胞對(duì)于MMP-9的表達(dá)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)E-cadherin表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，姜黃素可有效抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且與其藥物濃度存在劑量依賴關(guān)系。隨著姜黃素濃度的提高，腫瘤細(xì)胞凋亡率、侵襲抑制率和增殖抑制系數(shù)都較對(duì)照組或劑量較低的實(shí)驗(yàn)組有顯著升高，這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道相符。本研究中主要是在體外環(huán)境下利用A549細(xì)胞為載體研究姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響的，但針對(duì)在人體環(huán)境下姜黃素的藥理作用的研究較少，這將是下一步研究的方向。