高效液相色譜法測(cè)定咽炎片中木蝴蝶苷B含量

劉保社，曹福麟，曹望弟

（1．陜西歐珂藥業(yè)有限公司，陜西 商洛 711400； 2．陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；3．陜西省商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西 商洛 726000）

咽炎片由玄參、百部、天冬、牡丹皮、麥冬、款冬花、木蝴蝶、地黃、板藍(lán)根、青果、蟬蛻、薄荷油等中藥組方，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清熱解毒、清利咽喉、鎮(zhèn)咳止癢的功效，用于慢性咽炎引起的咽干、咽癢、刺激性咳嗽等。以往的咽炎片質(zhì)量控制探討了黃芩苷、沒(méi)食子酸、丹酚酸、肉桂酸和芍藥苷等的含量測(cè)定，并未建立木蝴蝶有效成分的含量測(cè)定方法。本研究中參考《中國(guó)藥典(一部）》[1]及文獻(xiàn)[2-16]，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定咽炎片中木蝴蝶的活性成分木蝴蝶苷B的含量，以有效控制其內(nèi)在質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（包括2489UV檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；SQP型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；AS1512560型超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

木蝴蝶苷B對(duì)照品（批號(hào)為111195-201603，含量為91．9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；咽炎片樣品（批號(hào)分別為 170701，171102，基片重 0．25 g），不含木蝴蝶的陰性對(duì)照品樣品，均由陜西歐珂藥業(yè)有限公司提供；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasi1100-5 C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-甲醇（B）-0．3% 磷酸溶液（C），梯度洗脫，0～30 min 時(shí) 15% →19．5%B、75% →69%C，30 ～40min 時(shí) 19．5%B、69%C；流速：0．8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取木蝴蝶苷B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇，得質(zhì)量濃度為0．043 2 g/L的對(duì)照品溶液；取除去包衣的咽炎片粉末1．24 g，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液適量，混勻，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲20 min，放冷，用70%甲醇溶液定容至刻度，快速過(guò)濾，取續(xù)濾液，微孔濾膜（0．45 μm）濾過(guò)，得供試品溶液；按處方比例，照處方制備工藝制成不含木蝴蝶的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：精密吸取陰性對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀。色譜圖中，在與對(duì)照品溶液木蝴蝶苷B峰相同位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取2．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1，2，4，8，12，16，20 μL，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=13 448X-13 147，r=1．000 0（n=7）。結(jié)果表明，木蝴蝶苷B進(jìn)樣量在0．04～0．86 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果木蝴蝶苷B峰面積的RSD為2．43%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液20 μL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果木蝴蝶苷B的RSD為1．97%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批除去包衣的咽炎片粉末6份，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算含量。結(jié)果木蝴蝶苷B含量的RSD為1．39%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批除去包衣的咽炎片粉末1．24 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入質(zhì)量濃度為0．011 g/L的木蝴蝶苷B對(duì)照品溶液，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 木蝴蝶苷B加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取2批（批號(hào)分別為170701，171102）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂方法測(cè)定，結(jié)果2批樣品中木蝴蝶苷 B 的含量分別為 0．254，0．253 mg/g。

3 討論

提取方法選擇：曾比較藥典中加熱回流、超聲提取等提取方法，考察在不同時(shí)間的提取效果及不同濃度的甲醇溶液對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，選用70%甲醇，超聲提取20 min，可充分提取樣品中的木蝴蝶苷B，簡(jiǎn)單易行，提取率較高。

流動(dòng)相選擇：曾對(duì)不同流動(dòng)相體系條件的色譜分離效果分別進(jìn)行了考察，分別比較甲醇-水、甲醇-水-磷酸、乙腈-甲醇-磷酸溶液為流動(dòng)相的效果。結(jié)果表明，以乙腈-甲醇-0．3%磷酸溶液作為流動(dòng)相，分離效果較好，故選擇其為流動(dòng)相梯度洗脫。

綜上所述，本研究中所建立的HPLC法測(cè)定咽炎片中木蝴蝶苷B的含量，操作簡(jiǎn)便，高效快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)于咽炎片的質(zhì)量控制具有積極意義，為該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步修訂提供了試驗(yàn)依據(jù)。