高效液相色譜法測定消旋山莨菪堿滴眼液中抑菌劑含量

戴麗娜，毛 睿，陳泳君

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000）

消旋山莨菪堿具有明顯的外周抗膽堿能作用，可松弛乙酰膽堿所引起痙攣的平滑肌，解除血管(尤其是微血管）痙攣，改善微循環。消旋山莨菪堿滴眼液可選擇性拮抗M1膽堿能受體，解除乙酰膽堿所致睫狀肌的痙攣，改善眼部微循環，從而減緩近視進展[1-2]。臨床消旋山莨菪堿滴眼液常用于治療和預防青少年假性近視。滴眼劑一般為多劑量給藥形式，在使用過程中無法始終保持無菌，抑菌劑的加入是必要的。現行消旋山莨菪堿滴眼液質量標準為國家食品藥品監督管理局標準[3-4]，其中未對抑菌劑進行質量控制，亦未見相關文獻報道。為了更好地控制該滴眼液的質量，參考文獻[5-7]，本研究中建立了高效液相色譜（HPLC）法測定消旋山莨菪堿滴眼液中常用抑菌劑羥苯乙酯、苯扎溴銨含量的方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司）；Sartorius BP211D天平（十萬分之一，Mettler Toledo公司）；超純水儀（Milli-Q）。

1.2 試藥

羥苯乙酯對照品（批號為100847-201203，含量為100%，苯扎溴銨對照品（批號為135051-201401，含量為10．9 g/L），均購于中國食品藥品檢定研究院；消旋山莨菪堿滴眼液（市售），規格均為0．05%（南京天朗制藥有限公司，批號分別為161005，170603；上海信誼金朱藥業有限公司，批號為1730703；武漢五景藥業有限公司，批號為17110401）；甲醇和三乙胺為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Aglient Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：1% 三乙胺溶液(用磷酸調pH至3．0，A）-甲醇(B），梯度洗脫(0min時 45%A，5 min 時45%A，10 min時 30%A，26 min時 30%A，36 min時45%A）；流速：1．0 mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。理論板數以羥苯乙酯峰計不低于6 000，羥苯乙酯、苯扎溴銨的分離度均大于1．5。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

分別精密稱取羥苯乙酯、苯扎溴銨對照品適量，加流動相溶解并制成質量濃度為 427．20，2 180．00 μg/mL的混合對照品貯備溶液。精密量取上述溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。精密量取樣品1 mL，置5 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按消旋山莨菪堿滴眼液的處方配制不含抑菌劑及主藥的樣品，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

圖1 高效液相色譜圖

線性關系與檢測限考察：精密量取2．2項下混合對照品貯備溶液 0．25，0．5，2．5，5，10，25 mL，分別置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，制成6個系列質量濃度的對照品溶液，注入高效液相色譜儀測定，計算峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標（X，μg/mL）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。取線性溶液繼續稀釋，取信噪比(S/N）約為3的溶液質量濃度為最低檢測限。結果見表1。

表1 線性關系及檢測限考察結果(n=6）

精密度試驗：精密吸取對照品混合溶液10 μL，重復進樣6次，按擬訂色譜條件測定峰面積。結果羥苯乙酯、苯扎溴銨峰面積的RSD分別為0．53%和0．68%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取抑菌劑為苯扎溴銨的供試品溶液Ⅰ（批號為161005）、抑菌劑為羥苯乙酯供試品溶液Ⅲ（批號為 1730703），分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 時進樣10 μL，記錄色譜圖，以峰面積為指標考察穩定性。結果表明，羥苯乙酯、苯扎溴銨峰面積的RSD分別為0．7%和0．9%（n=7），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取供試品溶液Ⅰ（批號為161005），供試品溶液Ⅲ（批號為1730703），依法制備6份供試品溶液，供試品溶液Ⅰ中苯扎溴銨的平均含量為0．047 g/L，RSD為0．8%（n=6）；供試品溶液Ⅲ中羥苯乙酯的平均含量為 0．253 g/L，RSD為 0．6% （n=6）。結果表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別取標示羥苯乙酯為抑菌劑的供試品溶液Ⅲ（批號為1730703）和標示苯扎溴銨為抑菌劑的供試品溶液Ⅰ（批號為161005）作為樣品，各9份，按低、中、高濃度水平分別精密加入羥苯乙酯和苯扎溴銨對照品，按2．1項下色譜條件測定，采用標準曲線法計算羥苯乙酯和苯扎溴銨的含量，計算回收率。結果見表2。

表2 羥苯乙酯、苯扎溴銨加樣回收試驗結果（n=9）

2.4 樣品含量測定

按擬訂色譜條件，依法制備溶液，對4批消旋山莨菪堿滴眼液樣品進行測定。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

3 討論

檢測波長選擇：由DAD掃描圖可知，羥苯乙酯在258nm和200nm波長處有最大吸收；苯扎溴銨在208nm波長附近有最大吸收，在210 nm波長處2種抑菌劑均有較大吸收，其檢出限、定量限均能達到定性、定量的要求。故本研究中選擇210 nm為檢測波長。

流動相選擇：參考文獻[8-9]，比較了甲醇-磷酸鹽緩沖液、甲醇-三乙胺溶液等度洗脫和梯度洗脫，最終確定甲醇-三乙胺溶液，并優化梯度洗脫程序。結果表明，選用甲醇-三乙胺溶液梯度洗脫，羥苯乙酯和苯扎溴銨的保留時間分別為6．8 min和23．7 min，出峰時間適宜，峰形好，苯扎溴銨峰和羥苯乙酯峰間的分離度符合要求，輔料無干擾。

抑菌劑的種類和用量分析：眼用制劑在使用過程中要求保持無菌，抑菌劑的加入是必要且重要的。查閱市售樣品的藥品說明書，處方中的抑菌劑多為羥苯乙酯、苯扎溴銨，分別屬尼泊金類、陽離子表面活性劑，均為常用眼用制劑抑菌劑。2015年版《中國藥典(二部）》對于眼用制劑明確規定了可加入適宜濃度的抑菌劑，但不應降低藥效或產生局部刺激，且大部分品種并未規定其含量限度[10]。收集的市售樣品中，一家生產廠家樣品在藥品說明書標示了防腐劑苯扎溴銨的處方量為0．05 g/L，但其實際含量分別為94．00%和96．00%，與標示量相符；另一家生產廠家標示了防腐劑為羥苯乙酯，但并未標示其處方量，結果為0．253 g/L；另一生產廠家未標注防腐劑及其含量，但檢測出其防腐劑為羥苯乙酯，含量為0．439 g/L。

綜上所述，本方法可在40 min內檢測出添加的抑菌劑成分及其含量，可有效地控制抑菌劑的加入量，方法靈敏、準確、重復性好，可用于消旋山莨菪堿滴眼液抑菌劑的含量測定。