副干酪乳桿菌FM-M9-1對D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠的修復機制

王 英，夏秀東，董 月，劉小莉，周劍忠*

（江蘇省農業科學研究院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

氧化應激是生物體內的活性氧/氮的產生數量超過體內抗氧化保護機制清除活性氧/氮數量的一種狀態[1]。在氧化應激狀態下形成的活性氧（reactive oxygen species，ROS）如超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫，能針對性地破壞生物膜脂質磷脂中的不飽和脂肪酸，導致細胞的系列過氧化反應，形成的氧化產物進一步作用于細胞的核酸和蛋白質，破壞細胞的正常功能，從而產生不同程度的氧化損傷[2-7]。目前研究結果顯示，與氧化應激有關的疾病涉及到機體系統的各個方面，包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、哮喘、過敏、糖尿病等疾病，另外還有些高血壓、高血脂、冠心病和癌癥等都與氧化損傷有著十分密切的關系[8-10]。

大量關于乳酸菌體內、外的抗氧化功能研究結果顯示，乳酸菌細胞和無細胞提取物在體外具有清除自由基、抑制脂質過氧化、螯合金屬離子等活性[11-17]。體內攝入乳酸菌對機體或細胞的氧化應激具有顯著的調節作用，能提高體內抗氧化相關功能基因的表達并降低體內過氧化產物的活力[18-20]。

目前，乳酸菌抗氧化功能一般都是通過體外篩選獲得，通過體外相關抗氧化指標的測定篩選乳酸菌[21-23]。但是體外篩選的環境與體內環境相差很大，已有很多學者對此提出異議，認為乳酸菌緩解氧化應激能力必須通過體內模型的驗證才有研究意義和應用價值。目前比較常用的一種小鼠氧化損傷模型是D-半乳糖長期給藥造成小鼠衰老的模型，這個模型比較接近小鼠自然衰老，表現出小鼠壽命縮短、體內氧化壓力上升等，可以用來觀察藥物的抗氧化作用。

副干酪乳桿菌FM-M9-1來源于傳統自然發酵食品，是具有優良的體外抗氧化能力的乳酸菌[24]。本研究以D-半乳糖誘導的氧化應激損傷模型小鼠為研究對象，研究飼喂副干酪乳桿菌FM-M9-1對氧化應激的體內干預和緩解作用，進而揭示緩解氧化損傷的機制，為開發針對氧化還原失衡和氧化應激損傷的功能性產品提供可靠的、具有自主知識產權的乳酸菌菌株資源。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物采用SPF級昆明種雄性小鼠，體質量（20±2）g，由揚州大學動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2012-0004。實驗動物普通飼料由青龍山飼料物廠提供。

副干酪乳桿菌FM-M9-1由江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室保存。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽與谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒 大連寶生物科技公司；引物由上海生物工程有限公司合成，其他常規試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

ABI7500Fast實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國應用生物系統公司；UV-1600PC紫外分光光度計 上海美普達科技有限公司；YQX-11厭氧培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；3K15臺式冷凍離心機德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼養

小鼠適應一周后，稱體質量，然后隨機分成5 組，每組10 只。將小鼠同室分籠喂養，采用自然光照，自由采食和飲水。飼養環境溫度（25±2）℃，相對濕度60%，實驗周期為60 d。

1.3.2 菌株FM-M9-1培養及菌體處理

挑取FM-M9-1單菌落至MRS液體試管中，37 ℃靜止培養18～20 h至穩定初期，以此為接種液，按體積分數3%的接種量轉接到MRS液體培養基中培養18 h，上述培養好的菌液5 000 r/min離心5 min收集菌體，用生理鹽水洗2 次后重懸菌體，調整菌體濃度分別為（5.01±0.05）×108CFU/mL和（5.01±0.05）×1010CFU/mL，備用。

1.3.3 小鼠分組

對照組：頸背部皮下每天注射200 mg/（kg·d）生理鹽水，灌胃0.2 mL生理鹽水；模型組、實驗組和VC組頸背部皮下每天注射D-半乳糖（200 mg/（kg·d））。其中，模型組灌胃0.2 mL生理鹽水；實驗組中，低劑量組灌胃0.2 mL菌體濃度為（5.01±0.05）×108CFU/mL的FM-M9-1菌液；高劑量組灌胃0.2 mL菌體濃度為（5.01±0.05）×1010CFU/mL的FM-M9-1菌液；VC組灌胃200 mg/（kg·d） VC。

1.3.4 小鼠肝臟和腎組織樣品的處理

實驗結束后，將小鼠禁食12～18 h，斷頸處死，迅速取出肝臟和腎臟，置于冰冷生理鹽水中漂洗拭干，稱質量，制備腎臟和肝組織勻漿液用于氧化應激標志物的測定和分析。

肝組織勻漿的制備：每只取出小鼠肝組織總質量的10%，加入9 倍組織質量的預冷生理鹽水，充分研磨勻漿，3 000 r/min離心15 min，棄沉淀，所得上清液即為肝勻漿液，備用。腎組織勻漿的制備同肝組織。

肝、腎組織勻漿液中蛋白質量濃度采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標準蛋白質，制作標準曲線，得到蛋白質量濃度（x/（mg/mL））與OD595nm（y）的回歸方程為y＝0.010 9x+0.081 4（R2＝0.998 6）。

1.3.5 氧化應激標志物的檢測與分析

利用試劑盒測定小鼠肝和腎臟組織中的GSH-Px、SOD活力以及蛋白質羰基、MDA含量。

1.3.6 qPCR法檢測Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的相對表達水平

用TRIzol試劑提取各實驗組小鼠肝和腎臟組織的RNA，超微量核酸分析儀測定濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA，SYBR Select Mast Mix：ABI配制10 μL反應體系，采用ABI7500Fast qPCR檢測Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的表達水平，引物序列如表1所示。以β-actin為內參基因，Ct值通過熒光定量儀的分析軟件給出，最后基因的表達水平用2－△Ct表示。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行實驗數據的統計和整理，采用SPSS 15.0和One-way ANOVA軟件進行統計和顯著性分析，數據以±s表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織GSH-Px活力的影響

蛋白質羰基和MDA含量、SOD、GSH-Px活力是反映機體氧化應激活力的4 個常見標志物。已有研究結果顯示，乳酸菌處理氧化損傷小鼠，能不同程度地提高小鼠機體組織中SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活力，同時降低蛋白質羰基化和MDA含量。Wang Yuzhen等[18]利用Lactobacillus casei Zhang菌株處理內毒素和D-半乳糖誘導的氧化損傷小鼠，發現Lactobacillus casei Zhang能夠顯著提高小鼠肝臟中的SOD活力，并顯著降低MDA含量。Kamaladevi等[20]利用Lactobacillus casei處理有機磷殺蟲劑誘導氧化損傷的秀麗隱桿線蟲，發現Lactobacillus casei能夠顯著提高線蟲的過氧化氫酶、SOD、GSH-Px、谷胱甘肽轉移酶等相關抗氧化酶的活力，進而緩解氧化損傷。Zhang Li等[25]利用Lactobacillus plantarum C88處理過氧化氫誘導的氧化損傷Caco-2細胞，發現Lactobacillus plantarum C88能夠顯著降低MDA含量，顯著提高細胞的SOD和總抗氧化酶活力，并呈現量效關系。

表2 不同處理對小鼠肝、腎GSH-Px活力的影響Table2 Effects of different treatment on GSH-Px activity in liver and kidney of mice

從表2可以看出，與對照組相比，模型組小鼠的腎臟、肝臟GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明D-半乳糖誘導的小鼠氧化損傷模型比較成功。與模型組相比，低、高劑量組均能不同程度地提高肝臟和腎臟組織中GSH-Px活力，但是低劑量組差異不顯著。

2.2 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織SOD活力的影響

在機體內，SOD具有清除超氧陰離子自由基的功能，保護細胞免受超氧陰離子自由基造成的損傷，在氧化還原平衡與氧化應激酶調節機制中扮演著重要角色。

表3 不同處理對小鼠肝、腎SOD活力的影響Table3 Effect of different treatments on SOD activity in liver and kidney of mice

由表3可知，與模型組相比，低、高劑量FM-M9-1均能不同程度地提高肝臟和腎臟組織中SOD活力，但是低劑量組小鼠的肝臟和腎臟組織中SOD活力升高不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織蛋白質羰基含量的影響

表4 不同處理對小鼠肝、腎蛋白質羰基含量的影響Table4 Effects of different treatments on protein carbonyl content in liver and kidney of mice

由表4可知，與對照組相比，模型組小鼠的腎臟和肝臟組織中蛋白質羰基的含量都顯著升高（P＜0.01或P＜0.001），表明D-半乳糖誘導的小鼠氧化損傷模型比較成功。與模型組相比，不同劑量組均能不同程度地下調肝臟和腎臟組織中蛋白質羰基含量，低劑量組的小鼠的肝和腎中蛋白質羰基含量下降不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織MDA含量的影響

MDA含量是反映機體內脂質過氧化程度的一項生物標志物，可以間接反映機體和細胞受ROS與自由基攻擊的氧化應激程度。

表5 不同處理對小鼠肝、腎MDA含量的影響Table5 Effects of different treatments on MDA content in liver and kidney of mice

由表5可知，與模型組相比，低、高劑量組均能不同程度地下調肝臟和腎臟組織中MDA含量，低劑量組小鼠腎臟組織的MDA含量與模型組相比差異不顯著（P＞0.05），肝臟組織中的MDA含量與模型組相比顯著降低（P＜0.05）。

2.5 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Sod基因表達水平的影響

圖1 不同處理小鼠腎臟和肝臟中Sod基因表達量Fig.1 Sod mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

如圖1A所示，與對照組相比，模型組小鼠腎組織Sod基因表達水平極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，VC組和高劑量組Sod基因表達水平極顯著提高（P＜0.01或P＜0.001），低劑量FM-M9-1能夠顯著提高Sod基因的表達水平（P＜0.05）。圖1B顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中的Sod基因表達水平極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，不同劑量乳酸菌和VC處理都能不同程度地提高Sod基因的表達水平。

2.6 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Gsh-Px基因表達水平的影響

GSH-Px是機體抗過氧化屏障的重要組分，其表達水平的高低與機體對過氧化損傷的修復有密切關系。

圖2 不同處理小鼠的腎組織和肝組織中Gsh-Px基因的表達水平Fig. 2Gsh-Px mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

由圖2可知，與對照組相比，模型組小鼠腎和肝組織中的Gsh-Px基因表達水平高度顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，高劑量乳酸菌和VC處理都能不同程度地提高Gsh-Px基因的表達水平，低劑量組變化不顯著。

2.7 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Nrf2基因表達水平的影響

核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）是氧化應激的防御機制之一，它調節并激活細胞內抗氧化應激系統中和活性氧、促進細胞存活、保持細胞內氧化還原穩定[26]。Zhou Ningna等[27]利用來源于Panax notoginseng的皂素處理損傷的SH-SY5Y細胞，發現Panax notoginseng的皂素能夠通過上調Nrf2的表達并增強Nrf2及其下游抗氧化系統活力，主要包括血紅素加氧酶和谷胱甘肽轉移酶，從而緩解細胞的ROS積累。

圖3 不同處理小鼠的腎組織和肝組織中Nrf2基因的表達水平Fig.3 Nrf2 mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

由圖3可知，與對照組相比，模型組小鼠腎和肝組織中的Nrf2基因表達水平高度顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，VC和高劑量FM-M9-1能夠極顯著提高肝和腎組織中Nrf2基因的表達水平（P＜0.01或P＜0.001）。低劑量FM-M9-1能夠顯著上調腎組織Nrf2基因表達水平（P＜0.05），肝組織中Nrf2基因表達水平未顯著上調（P＞0.05）。

2.8 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Trx基因表達水平的影響

硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）與煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）構成的Trx系統是一個廣泛分布于原核生物和真核生物的NADPH依賴的二硫化物還原酶系統，在機體氧化還原平衡及細胞增殖中發揮重要的調節作用[28]，Trx能夠直接清除細胞內過氧化氫及氧自由基等ROS，調節細胞內氧化還原平衡[29-30]。Yamada等[31]證實Trx能通過清除ROS保護高氧誘導的肺上皮細胞損傷。Tanaka等[32]在實驗中觀察到Trx缺失的細胞體內有ROS增加、凋亡細胞增多以及細胞色素c表達上調等現象，從而推斷Trx能清除線粒體內的ROS并在調節線粒體細胞凋亡的信號轉導過程中發揮重要作用。

圖4 不同處理的小鼠腎組織和肝組織中Trx基因表達水平Fig.4 Trx mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

由圖4可知，與對照組相比，模型組小鼠腎和肝組織中Trx基因表達水平顯著下調（P＜0.01或P＜0.001）。與模型組相比，高劑量FM-M9-1能夠極顯著上調Trx基因的表達水平（P＜0.01）；低劑量組腎組織Trx基因表達水平顯著上調（P＜0.05），但在肝組織中未顯著上調（P＞0.05）。

3 結 論

利用D-半乳糖誘導氧化損傷模型小鼠，研究不同劑量的FM-M9-1菌體對氧化損傷小鼠的修復作用，同時以VC作為陽性藥物對照，測定腎和肝組織中SOD、GSH-Px、MDA、蛋白質羰基含量，同時利用qPCR方法對小鼠肝臟和腎臟組織的Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的表達水平進行分析，揭示FM-M9-1緩解氧化損傷的作用機制。結果表明：低、高劑量FM-M9-1均能不同程度地提高小鼠肝和腎組織中的GSH-Px和SOD的活力，降低小鼠肝和腎組織中的蛋白質羰基和MDA含量，提高小鼠肝臟和腎臟組織中與抗氧化功能相關的Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的表達水平。推測FM-M9-1通過上調小鼠體內抗氧化相關基因Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx的表達，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px活力，抑制體內的蛋白質和脂肪的氧化損傷，最終達到緩解小鼠氧化損傷的作用。