免疫記憶與DNA疫苗

黃 丹，李樂山，楊文琳，孫匯苑

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的免疫學(xué)理論與技術(shù)在各類臨床疾病發(fā)病機(jī)制研究與預(yù)防治療中得到應(yīng)用。目前，免疫學(xué)研究中的一大熱點(diǎn)研究是免疫記憶（Immunological memory）。免疫記憶是指免疫系統(tǒng)與抗原接觸，產(chǎn)生對其初次的免疫應(yīng)答，當(dāng)免疫系統(tǒng)再次接觸該抗原時，通常會產(chǎn)生再次免疫應(yīng)答。這一種現(xiàn)象我們將其定義為免疫系統(tǒng)的記憶性。在免疫系統(tǒng)發(fā)生再次應(yīng)答時會具有迅速、強(qiáng)烈、特異性高和持久的特點(diǎn)。雖然免疫記憶可以防止同一疾病的再次發(fā)生，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在某些特定的疾病中免疫記憶會對治療效果或疾病恢復(fù)產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，通過研究免疫記憶的特征，以及免疫記憶何時對人體具有積極作用、何時對人體具有消極作用，并合理利用免疫記憶對于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)具有指導(dǎo)性意義。

1 免疫記憶的機(jī)制

免疫記憶分為B細(xì)胞免疫記憶和T細(xì)胞免疫記憶。二者分別在體液免疫和細(xì)胞免疫中產(chǎn)生作用。

對于體液免疫，當(dāng)外界抗原初次入侵機(jī)體時，刺激成熟B細(xì)胞活化，從而增殖分裂成中心母細(xì)胞，伴隨其表面受體BCR改變并與FDC濾泡性樹突狀細(xì)胞上的抗原結(jié)合，BCR親和性高的B細(xì)胞發(fā)生陽性選擇，大部分分化成為漿細(xì)胞，少部分成為記憶細(xì)胞，即長壽記憶B細(xì)胞和長壽漿細(xì)胞。再次接觸抗原時，記憶B細(xì)胞快速大量增殖產(chǎn)生漿細(xì)胞。體液免疫的免疫記憶反應(yīng)在抗體上表現(xiàn)為：第一次接觸抗原產(chǎn)生應(yīng)答時出現(xiàn)IgM，IgM增加到最大值時開始出現(xiàn)IgG。IgG出現(xiàn)時間晚但達(dá)到峰值后可以維持較長時間。初次免疫應(yīng)答后形成記憶細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體再次接觸抗原時便能在很短時間內(nèi)大量產(chǎn)生IgG且水平更高。

對于細(xì)胞免疫，當(dāng)外界抗原初次入侵機(jī)體時，刺激初始T細(xì)胞活化，活化后的T細(xì)胞變成效應(yīng)T細(xì)胞和變成記憶T細(xì)胞。其中，效應(yīng)T細(xì)胞中的輔助性T細(xì)胞幫助B細(xì)胞的活化，細(xì)胞毒性T細(xì)胞直接攻擊靶細(xì)胞。記憶T細(xì)胞在再次接觸抗原時快速大量增殖并轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細(xì)胞。記憶T細(xì)胞表面表達(dá)CD45RA-/CD45RO+，根據(jù)其分布位置的不同又分為兩個亞群：中央型記憶T細(xì)胞（Tcm）和效應(yīng)型記憶T細(xì)胞（Tem）。Tcm高表達(dá)CCR7與CD62L，而Tem低表達(dá)或者不表達(dá)CCR7與CD62L。兩個亞群分布位置也不同，Tem存在于非淋巴組織，效應(yīng)功能上的分化程度高，在再次接觸抗原時能快速行使效應(yīng)功能；Tcm高表達(dá)淋巴細(xì)胞歸巢受體（淋巴細(xì)胞巢是指淋巴細(xì)胞的定向游動，依賴于淋巴細(xì)胞表面的歸巢受體和內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)血管地址素的相互作用），能聚集于次級淋巴器官處，對凋亡的耐受性強(qiáng)，具有更強(qiáng)的生存能力和增殖潛能，在再次接觸抗原時，能夠快速增殖分化補(bǔ)充周圍的效應(yīng)T細(xì)胞。

2 免疫記憶的負(fù)面作用

雖然免疫記憶在預(yù)防同一疾病方面作用明顯，但是這種機(jī)制也有負(fù)面作用。相關(guān)臨床醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)免疫記憶在腫瘤的發(fā)生、自身免疫疾病和器官移植上有明顯的負(fù)面作用。

Byren KT等人利用免疫組化技術(shù)研究黑色素瘤時發(fā)現(xiàn)CD45RO+的記憶細(xì)胞亞群高表達(dá)具有免疫抑制性的白細(xì)胞介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），抑制了效應(yīng)細(xì)胞。同時腫瘤細(xì)胞封閉自身細(xì)胞膜上的抗原，使癌細(xì)胞更難以識別，加速了腫瘤轉(zhuǎn)移。

Valujskikh A等人在器官移植手術(shù)中發(fā)現(xiàn)移植器官能否長期存活取決于對T細(xì)胞介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)的耐受。器官移植一般都選擇親屬中最匹配的人作為供體，但是研究發(fā)現(xiàn)記憶T細(xì)胞遇到同種抗原時會快速增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞并侵入移植器官中以引起移植失敗，所以，移植親屬的器官風(fēng)險很大。臨床上一般選擇切除接受器官移植患者的胸腺或讓患者服用抑制T細(xì)胞活性的藥物，但這降低移植器官后患者對外界病原體的抵抗力。另外，在骨髓移植手術(shù)中，供體的免疫細(xì)胞在移植后易攻擊宿主組織器官，引起植物抗宿主病（GVHD），這也是由記憶T細(xì)胞亞群所介導(dǎo)。CD45RC表達(dá)量高的CD4+記憶T細(xì)胞能夠誘導(dǎo)GVHD的產(chǎn)生。但CD62L-的記憶T細(xì)胞能夠抑制GVHD的產(chǎn)生，所以，通過醫(yī)療手段增加患者體內(nèi)CD62L-的記憶T細(xì)胞，并減少CD45RC表達(dá)量高的CD4+記憶T細(xì)胞是消除骨髓移植排斥反應(yīng)的好方法。

Beynon V等人在研究免疫記憶對于自身免疫疾病的影響中發(fā)現(xiàn)，正常情況下免疫系統(tǒng)對于自身的成分處于耐受狀態(tài)，而一旦失調(diào)會產(chǎn)生相關(guān)免疫系統(tǒng)疾病。比如多發(fā)性硬化患者外周血液的CD8+Tcm含量明顯增加，CD8+Tem含量明顯減少，說明多發(fā)性硬化發(fā)生過程中可能存在記憶細(xì)胞亞群。CD8+的Tcm/Tem的比值明顯增加也可能與多發(fā)性相關(guān)硬化免疫應(yīng)答有關(guān)，比如相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液中記憶性CD8+T細(xì)胞含量減少而在尿液中含量增加，這是由于這些患者體內(nèi)的記憶性CD8+T細(xì)胞大量從血液中轉(zhuǎn)移至腎臟中并產(chǎn)生巨大傷害。綜上所述，在治療疾病時，需要考慮降低或者避免免疫記憶帶來的負(fù)面作用。

3 DNA疫苗

DNA疫苗是在分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的第三代新型疫苗，現(xiàn)在已表現(xiàn)出相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。相比于傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗具有免疫效果好、造價低、臨床應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)。由于提出時的有關(guān)技術(shù)還未滿足需求，所以，DNA疫苗的安全性廣受質(zhì)疑。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，目前，已能生產(chǎn)出風(fēng)險低、效益高的DNA疫苗。DNA疫苗的本質(zhì)是連接有病原體抗原基因的真核表達(dá)載體。類似傳統(tǒng)疫苗的作用機(jī)理，DNA疫苗行使免疫功能也需要經(jīng)過3步類似傳統(tǒng)疫苗的作用過程：①抗原侵入。即將抗原物質(zhì)注入機(jī)體，DNA疫苗往往依賴于載體被動進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞，在載體注入機(jī)體后被機(jī)體上皮細(xì)胞或肌細(xì)胞內(nèi)吞攝入或直接被APC抗原呈遞細(xì)胞吞噬。②抗原基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。真核表達(dá)載體在設(shè)計過程中應(yīng)考慮外源基因的表達(dá)問題，所以，DNA疫苗人工添加了強(qiáng)啟動子和相關(guān)表達(dá)調(diào)控序列以增強(qiáng)表達(dá)能力，使其表達(dá)能夠通過人工調(diào)控進(jìn)行。當(dāng)含有外源抗原基因的DNA疫苗被單核巨噬細(xì)胞吞噬后，抗原基因在強(qiáng)啟動子作用下借助宿主細(xì)胞表達(dá)抗性蛋白，同時，細(xì)胞內(nèi)部修飾抗性蛋白，形成特異性短肽。③抗原呈遞和機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活。合成的特異性抗原短肽可與MHC主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合并暴露在APC細(xì)胞表面，通過與T細(xì)胞的雙識別激活CD8+T細(xì)胞增殖，產(chǎn)生特異的CTL效應(yīng)細(xì)胞。MHC類分子與Th細(xì)胞雙識別，激活CD4+T細(xì)胞，Th細(xì)胞活化后增殖分泌大量可溶性細(xì)胞因子，刺激B細(xì)胞的增殖和分泌抗體以誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫，并且產(chǎn)生免疫記憶。

4 DNA疫苗降低免疫記憶負(fù)面作用的機(jī)制

Cristillo等人在免疫試驗中證明DNA疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。相關(guān)人員利用含HIV病毒遺傳物質(zhì)的gp120質(zhì)粒注射入恒河猴肌肉后，恒河猴體內(nèi)產(chǎn)生了高效的中和性抗體，能夠有效抵抗HIV病毒的攻擊。這說明DNA疫苗發(fā)揮免疫應(yīng)答作用的機(jī)制之一是誘發(fā)抗體反應(yīng)。另外，他們發(fā)現(xiàn)在含有HIV遺傳物質(zhì)的gp120質(zhì)粒處理后的恒河猴體內(nèi)的輔助性T細(xì)胞因子和功能性CTL細(xì)胞能夠維持長達(dá)1年時間的活性，這也證明了DNA疫苗還可以通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫而抵抗疾病。同時，功能性的CTL細(xì)胞可以識別與MHCⅠ類分子相連的約為9～11個氨基酸長度的抗原肽，由DNA免疫產(chǎn)生的外源蛋白抗原與MHCⅠ類分子結(jié)合后進(jìn)入抗原提呈系統(tǒng)有助于CTL細(xì)胞識別這些抗原肽。

綜上所述，免疫記憶對人體的負(fù)面作用大部分來自記憶性T細(xì)胞亞群數(shù)量的明顯變化。魏海峰等人在利用CEA迷你肽表位基因疫苗誘導(dǎo)小鼠抗腫瘤免疫的研究中發(fā)現(xiàn)并構(gòu)建了含有CEA625-667基因單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯(lián)體DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667，將重組的DNA疫苗注入小鼠體內(nèi)后，記錄小鼠免疫系統(tǒng)內(nèi)癌胚抗原和相關(guān)記憶細(xì)胞亞群的數(shù)量變化，比較對照組發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)的癌胚抗原和相關(guān)腫瘤促進(jìn)因子含量也明顯減少。免疫小鼠T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果中的兩部分pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667和空質(zhì)粒pcDNA3.0組免疫小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+值比較無明顯差異，說明抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)的部分記憶T細(xì)胞亞群數(shù)量并未發(fā)生增加。與全序列基因疫苗比較，迷你基因疫苗能夠針對特異性抗原表位誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，避免無關(guān)抗原表位的影響。結(jié)果表明，迷你基因3倍體疫苗所引發(fā)的增殖效應(yīng)以及釋放細(xì)胞因子的水平均高于迷你基因單倍體，說明所采用的目的基因多倍串聯(lián)的抗原改造方式增強(qiáng)了免疫效應(yīng)，也降低了免疫記憶的負(fù)面作用。魏海峰等人得到結(jié)論CEA迷你肽表位基因單倍體及3倍體疫苗不僅明顯改變動物體內(nèi)CD4/CD8比值，有效降低免疫記憶促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散的負(fù)面影響，還能誘導(dǎo)HTL活化，使被免疫機(jī)體T細(xì)胞趨向于Th1效應(yīng)且3倍體疫苗的免疫原性強(qiáng)于單倍體疫苗。

5 結(jié)論

免疫記憶是一把雙刃劍，它既能在防止同一疾病的再次發(fā)生上起到正面作用，又能在腫瘤發(fā)生、器官移植和自身免疫疾病方面起到負(fù)面作用。臨床方面要注意對免疫記憶進(jìn)行合理控制。DNA疫苗是第三代新型疫苗，可在一定水平上降低免疫記憶的負(fù)面作用，因此，可以指導(dǎo)醫(yī)學(xué)免疫工作者在設(shè)計疫苗時根據(jù)不同的病原體引起的免疫應(yīng)答設(shè)計誘導(dǎo)相應(yīng)抗體或記憶細(xì)胞產(chǎn)生的疫苗，同時，控制記憶細(xì)胞中具有免疫抑制活性的亞群。

參考文獻(xiàn)：

［1］馬祖祥，趙維玲，高曉潔，等.免疫記憶：一把雙刃劍［J］.中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2014（03）：228-232.

［2］吳長有.DNA疫苗與免疫記憶［G］//中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會：全國第二屆核酸疫苗研討會論文集，2005：2.

［3］吳長有.免疫記憶與疫苗研究開發(fā)［J］.中國免疫學(xué)雜志，2005（01）：4-7.

［4］高基民.DNA疫苗——解開免疫記憶之謎的鑰匙？［J］.生命的化學(xué)（中國生物化學(xué)會通訊），1995（03）：13-14.

［5］劉中芹，王曉瓊，張國慶，等.乙肝疫苗免疫5年后抗-HBs衰減兒童免疫記憶觀察［J］.中華疾病控制雜志，2016，（03）：315-316，322.

［6］Guirola María，Urquiza Dioslaida，Alvarez Anabel，et al.Immunologic memory response induced by a meningococcal serogroup C conjugate vaccine using the P64k recombinant protein as carrier［J］.FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006（462）.