酶解羅非魚下腳料制備降血壓肽的研究

趙 闊，張紅建，陳 艷，鄒 易，謝嬌梅，鄭聯合

（海南省糧油科學研究所，海南瓊海 571400）

高血壓是困擾全球的一種心血管疾病，常伴有血管、大腦、心、腎等器官器質性病變，是誘發中風、冠心病、腦卒死、心肌梗死和腎功能衰竭的最主要因素，被稱為“無聲殺手”[1-3]，已發展成為一個十分嚴重的社會公共衛生問題[4]。我國目前的高血壓患者達2.7億人[5]，發病率隨著經濟的增長逐年增高，每年死于心血管疾病的人數達200萬人。當前，應用最普遍、藥效最明顯的主要是卡托普利、賴諾普利等人工合成的降血壓藥物，但對腎臟存在一定副作用，服藥后會出現干咳、低血壓等癥狀[6]。

降血壓肽，是一類能夠降低血壓的多肽活性物質，通過抑制血管緊張素轉化酶（ACE） 的活性，阻礙血管緊張素Ⅱ的生成及抑制血管舒緩激肽的分解，從而使血壓下降[7-8]。降血壓肽來源于食物蛋白，安全性高、無毒副作用，且對血壓正常者無降壓作用，適合長期服用，無論在功能性食品還是在醫藥產品開發方面都具有廣闊的應用前景[9-10]。

羅非魚（Tilapia）俗稱非洲鯽魚、福壽魚，肉質厚、白潔無刺、味道鮮美，在國際市場很受歡迎，是海南水產品加工企業出口的主要魚種之一。羅非魚加工會產生大量的下腳料，如魚鱗、魚頭、魚內臟、殘肉等，總質量約占整條魚的54%[11-12]，造成蛋白資源的浪費。為提高羅非魚下腳料的附加值，開展了酶解制備降血壓肽的研究，并優化了工藝參數，為降血壓肽的開發和生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚下腳料：市購新鮮羅非魚，將魚肉剔除，于-20℃條件下凍存，試驗時于4℃下解凍。

血管緊張素轉換酶（ACE），從新鮮豬肺中提取；胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-8000S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限責任公司產品；HDK-6型數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州德科儀器制造有限公司產品；S-D200型高效組織搗碎機，上海模具廠產品；Sigma 3-30k型高速冷凍離心機，上海譽鑫科技有限公司產品；RG-18型磁力攪拌器，上海瑪尼儀器設備有限公司產品；QDN-ll型全自動凱氏定氮儀，杭州匯爾儀器設備有限公司產品；PB-10型pH計，德國賽多利斯科學儀器有限公司產品；SB5200DTD型超聲波清洗機，寧波新藝生物科技有限公司產品；玻璃干燥器，沈陽一化玻商貿有限公司產品；AY220型電子天平，日本島津公司產品；UPN-11-10T型超純水制造系統，四川優普超純科技有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚下腳料酶解

稱取一定質量的羅非魚加工下腳料，將其剪成小塊，按所需底物質量分數加水，用高速組織搗碎機絞碎，調節所需pH值，在設定溫度下加酶水解一定時間，沸水浴滅活10 min，冷卻后以轉速3 500 r/min離心10 min，中間部分的澄清液即為酶解液。

1.3.2 蛋白酶的篩選[13]

選取6種常用蛋白酶（堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合蛋白酶），結合生產廠家提供的各種蛋白酶的最適酶解條件，調節pH值和酶解溫度，分別對羅非魚下腳料進行水解，根據水解度和ACE抑制率，篩選出最佳用酶。

蛋白酶水解條件見表1。

表1 蛋白酶水解條件

1.3.3 酶解工藝優化

選取水解作用較強的酶，在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度、加酶量、底物質量分數和pH值4個因素開展L16（35）正交試驗，以水解度和ACE抑制率為指標，對酶解條件進行優化。

正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計

1.3.4 水解度測定的方法[14]

水解度（DH） 指蛋白質分子發生酶解反應后斷裂的肽鍵占蛋白質分子中總肽鍵的比例，反映蛋白質的水解程度。

氨基酸態氮（AAN） 含量的測定（參照GB 5009.235—2016中比色法）。

總氮含量的測定（參照GB 5009.5—2016中凱氏定氮法）。

1.3.5 ACE抑制率測定的方法[15]

在 2 mL離心管中混合 50 μL樣品和 200 μL 0.005 mol/L HHL。置于37℃水浴中預熱5 min，然后加入50 μL粗提的ACE啟動反應；于37℃下水浴30 min，而后加0.2 mL 1 mol/L鹽酸終止反應；吸取1.2 mL預冷的乙酸乙酯于管中，用力振蕩混合，以轉速3 500 r/min離心5 min。吸取0.8 mL上層液于試管中，于85℃烘箱中烘干；最后，加入4 mL去離子水溶解馬尿酸，于波長228 nm處測定其吸光度。對照組不加入抑制劑，空白組反應前加入0.2 mL 1 mol/L的鹽酸終止反應，其余操作與樣品組操作一致。

式中：ODa——對照組的吸光度；

ODb——樣品組的吸光度。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

6種蛋白酶分別在各自最適酶解條件下酶解處理羅非魚加工下腳料。

不同蛋白酶酶解羅非魚下腳料效果見圖1。

由圖1可知，6種蛋白酶對羅非魚下腳料的酶解能力由高到低依次為復合蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶；各酶解液ACE抑制率由高到低依次為復合蛋白酶＞胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。水解度低的中性蛋白酶酶解產物ACE抑制率卻不低，可見水解度和ACE抑制率并無顯著直線線性關系，分析原因可能是因為各蛋白酶的作用方式和作用位點有所不同，導致酶解產物ACE抑制率不同。綜合考慮，確定選取復合蛋白酶為目標用酶，該酶反應條件相對溫和、試驗條件易于控制、水解度和ACE抑制率相對較高。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解溫度對酶解反應的影響

配制5份底物質量分數為20%的羅非魚下腳料溶液，調節pH值至7，加入復合蛋白酶，加酶量（E/S%） 為 10 000 U/g，分別在 40，45，50，55，60℃下酶解5 h，之后沸水浴中加熱10 min，離心，測定各酶解液的水解度和ACE抑制率，分析不同溫度對酶解反應的影響。

酶解溫度對酶解反應的影響見圖2。

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，水解度和抑制率均呈先上升后下降的趨勢，當酶解溫度達到50℃時，水解度和抑制率達到最高；當酶解溫度超過50℃，酶活性降低，水解度和抑制率開始下降。適宜溫度是保持酶活力的關鍵，不適宜的溫度會破壞蛋白酶活性部位的完整性，從而對其酶解作用能力造成影響。因此，復合蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳酶解溫度為50℃。

2.2.2 加酶量對酶解反應的影響

配制5份底物質量分數為20%的羅非魚下腳料溶液，調節pH值至7，加入復合蛋白酶，加酶量（E/S%） 分別為 6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 U/g，于50℃下酶解5 h，滅活、離心，測定各酶解液的水解度和ACE抑制率，分析不同加酶量對酶解反應的影響。

加酶量對酶解反應的影響見圖3。

由圖3可知，水解度隨加酶量的增加而增大，并逐漸趨于平緩。加酶量增加到12 000 U/g時，酶解液ACE抑制率最高，之后加酶量增加ACE抑制率降低，可能是因為酶活過高引起了降血壓肽的進一步水解。因此，復合蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳加酶量為12 000 U/g。

2.2.3 底物質量分數對水解反應的影響

配制底物質量分數分別為10%，15%，20%，25%，30%的羅非魚下腳料溶液各1份，調節pH值至7，加入復合蛋白酶，加酶量（E/S%）為10 000 U/g，于50℃下水解5 h，滅活、離心，測定各酶解液的酶解度和ACE抑制率，分析不同底物質量分數對酶解反應的影響。

底物質量分數對酶解反應的影響見圖4。

由圖4可知，酶解度和抑制率隨底物質量分數的增加基本呈上升趨勢，分析原因可能是因為底物質量分數低時，降低了酶的濃度，使得酶與底物無法充分接觸，影響了酶解效果，當底物質量分數增加到20%時，水解度和抑制率達到最大值，之后，底物質量分數增加水解度變化不明顯，抑制率略有下降。因此，復合蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳底物質量分數為20%。

2.2.4 pH值對酶解反應的影響

配制底物質量分數為20%的羅非魚下腳料溶液5份，分別調節pH值至 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加入復合蛋白酶，加酶量（E/S%） 為10 000 U/g，在水解溫度50℃下酶解5 h，滅活，離心，測定各酶解液的酶解度和ACE抑制率，分析不同pH值對酶解反應的影響。

pH值對水解反應的影響見圖5。

由圖5可知，pH值＜7.5時，水解度和抑制率隨著pH的升高而增加；pH值＞7.5時，pH值升高水解度和ACE抑制率反而減小。pH值直接影響到酶和底物分子的某些解離狀態，從而影響酶解效果。因此，復合蛋白酶解羅非魚下腳料的最佳pH值為7.5。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以酶解溫度、加酶量、底物質量分數和pH值4個因素，以酶解度和ACE抑制率為指標，開展正交試驗。

復合蛋白酶酶解正交試驗結果見表3，復合蛋白酶酶解正交試驗結果方差分析見表4。

表3 復合蛋白酶酶解正交試驗結果

由表3可知，影響水解度的因素主次順序為A＞C＞D＞B，即酶解溫度＞底物質量分數＞pH值＞加酶量，最優組合為A2B3C3D3；而影響抑制率的因素主次順序為C＞A＞D＞B，即底物質量分數＞水解溫度＞pH值＞加酶量，最優組合為A2B2C3D3。2個組合的差別僅在于因素B是取第二水平還是第三水平。由表4可知，水解溫度（A） 和底物質量分數（C） 對水解度和抑制率均影響顯著，加酶量（B）和pH值（D）對水解度合抑制率均沒有顯著影響，且加酶量對抑制率影響比對水解度影響要強。因此，將加酶量的最適條件優化為B2，符合蛋白酶水解工藝的最適組合為A2B2C3D3，即水解溫度47℃，加酶量12 000 U/g，底物質量分數20%，pH值7.5。以最適組合條件進行驗證試驗，羅非魚下腳料酶解度和抑制率分別為77.45%和70.12%。

表4 復合蛋白酶酶解正交試驗結果方差分析

3 結論

通過對比胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶等6種蛋白酶酶解羅非魚下腳料的效果，確定復合蛋白酶為目標用酶，該酶反應條件相對溫和、試驗條件易于控制、水解度和ACE抑制率相對較高。通過單因素試驗和正交試驗，對復合蛋白酶水解羅非魚下腳料制備降血壓肽的工藝條件進行了優化，最適條件為水解溫度47℃，加酶量12 000 U/g，底物質量分數20%，pH值7.5，此工藝條件下酶解度與抑制率分別為77.45%和70.12%。