木瓜濾渣微波輔助提取木瓜多糖的響應面法工藝優化及其抗氧化活性研究

張彥慧，李彥霏，胡仲秋

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2.中國農業大學工學院，北京 100083）

0 引言

木瓜，我國獨特的古老果樹之一，產量極高，僅云南省的木瓜年產量就可達500×104kg[1]。同時，木瓜有極高的藥用價值和營養價值[2]，研究表明，木瓜富含維生素、天然植物“多糖”、礦物質、蛋白質等，俗語有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之稱[2-4]。多糖為木瓜的主要活性成分之一，含量豐富[5-6]，作為一種重要的生物活性物質，木瓜多糖不僅能調節機體的免疫能力[6-8]，而且具有抗腫瘤、抗氧化[9]、抗感染、抗病毒等多種生物功能[10-14]。而人類機體內氧自由基占總自由基的95%以上，對機體細胞和組織有嚴重損傷作用，是引發人體衰老的主要原因[15]，適量補充抗氧化物質則能延緩上述情況的發生。近年來，高抗氧化活性物質的開發利用受到大眾廣泛重視，也是當今社會對植物資源利用的新趨勢[16]。

微波輔助提取技術已被廣泛用于植物有效活性成分的提取，在提取過程中，既保證有效成分的充分溶出，又可防止提取物降解，對于某些物質的提取效果明顯優于其他方法[17]。響應曲面法（Response Surface Methodology，RSM） 主要用于多變量研究[18]，目前，將響應面法用于優化微波輔助提取木瓜多糖工藝鮮有報道。試驗以提取過綠原酸的木瓜濾渣為原料，采用微波輔助熱水提取法提取木瓜多糖，在單因素試驗基礎上應用響應面分析法對提取工藝影響較大的4個因素即料液比、水浴溫度、微波時間、提取時間進行優化，獲得微波輔助熱水提取木瓜多糖的最佳工藝條件。采用DPPH法和Fenton反應[19]考查上述方法所提取木瓜多糖的體外抗氧化[20]活性，旨在為木瓜的產業化綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

木瓜，陜西凱興中藥飲片有限公司提供，采用經粉碎，提取綠原酸后獲得木瓜濾渣；葡萄糖、水楊酸，天津市登峰化學試劑廠提供；正丁醇、氯仿，天津市博迪化工有限公司提供；重蒸酚，北京鼎國生物技術有限責任公司提供；濃硫酸、無水乙醇，西安三浦精細化工廠提供；蒸餾水，西北農林科技大學提供；硫酸亞鐵、氫氧化鈉，西安化學試劑廠提供；30%過氧化氫（雙氧水），上海麥克林生化科技有限公司提供；石油醚、乙醚，天津市恒興化學試劑制造有限公司提供；DPPH（二苯基苦味酰基苯肼、1,1-dipheny,1-2-picrylhydrazyl）。

1.2 儀器與設備

MP200B型電子天平，上海精科天平雙圈牌產品；HH-6型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產品；SHB-III型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司產品；P7021TP-6型格蘭仕微波爐，上海隆譽微波設備有限公司產品；B-490S型旋轉蒸發儀，瑞士Buchi公司產品；PK121R型離心機、UV-2550型紫外分光光度計、UV-1700型紫外可見分光光度計（波長范圍190.0～990.0 nm）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制作

稱取無水葡萄糖制得葡萄糖的標準溶液，依次取上述標準液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置于8個10 mL帶刻度的試管中，加蒸餾水分別補至2 mL。每個試管均加入1.0 mL苯酚溶液（5%，4℃），搖勻，加入濃硫酸7.0 mL，于50℃的水浴鍋中保溫40 min后取出。將所有溶液迅速冷卻到室溫，以第一濃度作為空白，按照分光光度法于波長490 nm處（掃描確定的最佳波長）測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3.2 木瓜多糖的提取及測定

準確稱取提取綠原酸后的木瓜濾渣粉末0.5 g，加入一定比例的蒸餾水，在500 W功率下使用微波輔助提取一定時間，并以一定溫度水浴一定時間后，抽濾并離心，吸取上清液，加Sevag試劑（正丁醇∶氯仿=1∶5（V∶V））去蛋白，上層溶液稀釋100倍，苯酚硫酸法比色。

取稀釋1 000倍的多糖提取液于分光光度計中，以空白試樣用作參比依次測定吸光度，記錄樣品的吸光度。根據樣品的吸光度代入標準曲線方程求取其濃度。提取量計算如下：

式中：Y——多糖提取量，mg/g；

C——由吸光度測得質量濃度，mg/L；

V——定容體積，mL；

m——木瓜濾渣的質量，g；

f——換算因子f=1.567[21]。

1.3.3 單因素試驗設計

按照1.3.1微波提取方法的步驟，準確稱取0.5 g濾渣，研究純化水-干燥濾渣（即料液比）、微波時間、水浴溫度和水浴時間4個因素對木瓜水溶性多糖提取量的影響。①固定微波功率500 W，提取時間30 s，在80℃的水浴溫度下提取60 min，考查不同的料液比 1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g∶mL）對提取量（mg/g） 的影響。固定料液比1∶40（g∶mL），微波功率500 W，在80℃水浴溫度下提取多糖60 min，考查微波時間分別為10，20，30，40 s時對提取量的影響。②固定料液比1∶40（g∶mL），微波功率500 W，微波時間20 s，水浴提取多糖60 min，考查水浴溫度依次為60，70，80，90℃時對提取量的影響。③固定料液比1∶40（g∶mL），微波功率500 W，微波輔助提取20 s，在80℃水浴下考查提取時間45，60，75，90 min對試驗結果的影響。

1.3.4 Box-Benhnken試驗設計

以單因素試驗結果為基礎，每個因素選擇3個影響較大的水平，以木瓜多糖提取量為響應值，建立四因素三水平中心組合試驗，各因素3個水平采用-1，0，1進行編碼。

微波法提取木瓜多糖因素與水平設計見表1。

表1 微波法提取木瓜多糖因素與水平設計

1.3.5 木瓜多糖的抗氧化性試驗

稱取適量優化工藝條件下得到的木瓜多糖，配制稀釋成4，5，6，7，8倍的多糖溶液，進行其抗氧化活性試驗研究。

（1） DPPH·清除率的測定。配制DPPH·標準液（6.5×10-4mol/L），于100 mL容量瓶中稀釋10倍，定容待測。參照Chen Y T等人[22]對生姜成分的抗氧化活性研究中的操作方法，定量移取多糖溶液、50%乙醇溶液和DPPH·；另取一支試管加入1 mL 50%乙醇溶液和4 mL DPPH·10倍稀釋液作為空白組進行對照。以上所配樣品置于暗處靜置20 min，離心10 min（轉速3 000 r/min），于波長517 nm處測定吸光度。

樣品 DPPH·（Scavenging activity，SA） 的清除公式可表示為：

式中：Ai——樣液反應后吸光度；

Aj——溶劑混合液、DPPH·混合吸光度；

Ao——樣液、溶劑混合液混合吸光度。

（2） 羥基自由基消除能力測定。參照Chen Y T等人[22]對生姜成分的抗氧化活性研究中的操作方法，分別配制含有定量FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L） 和 H2O2溶液（8.8 mmol/L） 的試樣，依次加入上述一定倍數的提取液，于37℃下恒溫水浴反應30 min，于波長510 nm處測定樣品吸光度。

·OH清除率公式為：

式中：A′i——加提取液后吸光度，

A′j——不加顯色劑的提取液本底吸光度，

A′o——對照液吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

2.1.1 葡萄糖波長的掃描

從1.3.1步驟中任選3個濃度的標準溶液，以400～900 nm的波長范圍，在分光光度計上進行波長掃描。

3個不同葡萄糖標準溶液在400～900 nm波長下掃描波長圖譜見圖1。

由圖1發現除去儀器的波動，大部分樣品都在波長490 nm左右有明顯的最大吸收峰，因此得出葡萄糖溶液的最大吸收波長為490 nm。故選取490 nm為該試驗分光光法的檢測波長。

2.1.2 葡萄糖標準曲線的繪制

由1.3.2測定步驟測得標準吸光度，繪制標準曲線。

葡萄糖標準液的標準曲線見圖2。

由圖2可知，在該試驗和儀器條件下吸光度和質量濃度的關系為Y=0.055 04X+0.008 66，R2=0.995 51（Y為吸光度；X為標準溶液質量濃度，mg/L）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對木瓜多糖提取量的影響

不同料液比對木瓜多糖提取量的影響見圖3。

由圖3可知，通過不同料液比的木瓜多糖提取量對比可以發現，料液比為1∶20～1∶40時提取量逐漸升高，這和陳毅挺等人對翻白草的提取工藝研究中，料液比對試驗結果影響的增長趨勢一致，說明較多的溶劑利于木瓜中多糖的析出，但當料液比超過1∶40時多糖的提取量有所下降，故選擇料液比為1∶40。

2.2.2 微波時間對木瓜多糖提取量的影響

不同微波時間對木瓜多糖提取量的影響見圖4。

由圖4可知，微波時間為10～20 s木瓜多糖提取量迅速提高，20 s后開始降低。說明在一定時間內微波時間加長可以使木瓜多糖的提取量迅速升高，但是到了一定的時間后其提取量就會達到飽和，并可能使原料中的多糖發生分解，導致多糖提取量降低，這與王安良等人[23]在優化山藥中多糖的微波提取工藝研究中，微波時間對多糖提取量的影響是一致的。微波法作為一種輔助提取方法，由于其會使溫度在短時間迅速上升，部分多糖分解而造成損失，綜合考慮提取量、提取成本等因素，初步確定微波處理時間為20 s。

2.2.3 水浴時間對木瓜多糖提取量的影響

不同水浴時間對木瓜多糖提取量的影響見圖5。

由圖5可知，水浴時間分別為45，60，75，90 min時，木瓜多糖提取量前段時間先增加，時間較長后減小。分析原因可能是提取時間短時，提取物的溶解不充分，而提取時間過長時，則會引起提取成分分解，造成提取產量的下降。如陳小梅等人[24]在提取滸苔多糖時，也出現了相同的現象。4個水平中多糖提取量最高值在45 min時出現，因此選取45 min作為參考水浴時間。

2.2.4 水浴溫度對木瓜多糖提取量的影響

不同水浴溫度對木瓜多糖提取量的影響見圖6。

由圖6可知，當水浴溫度分別為60～90℃時，木瓜多糖提取量先增加后減小，在80℃之前變化明顯，60～80℃為上升階段，增勢較陡，從80℃后降低，說明在一定的溫度下，提取溫度的增加可以使木瓜多糖提取量增加，但是到達一定的溫度時，提取溫度升高不會使提取量增加，可能由于隨著溫度的升高，木瓜多糖結構隨之遭到破壞，活性喪失，導致提取率下降。這與付瑞敏等人[25]在響應面分析法優化野木瓜多糖提取工藝中，提取溫度對提取量的影響一致，故在4個水平中，選擇80℃為水浴提取溫度。

2.3 微波法提取木瓜多糖的響應面試驗優化設計的試驗結果

微波法提取木瓜多糖時微波時間（B）、水浴時間（C）、水浴溫度（D） 和料液比（A） 對多糖產量的響應結果如下表8所示。

響應面優化試驗設計及結果見表2。

表2 響應面優化試驗設計及結果

利用二次多項式擬合后，得到回歸方程：

回歸模型方差分析見表3。

由表3可知，一次項、二次項及交互項對試驗結果的影響顯著性不高。但失擬項檢驗不顯著（p＞0.05)，說明回歸方程與試驗結果擬合較好，模型方程還是具有一定的現實意義。在該試驗范圍內，最優的提取工藝為料液比1∶40（g∶mL），500 W微波處理30 s，然后在90℃下水浴提取60 min。經驗證試驗驗證后，模型方程的預測結果與實際試驗結果吻合度較高。比相同條件下傳統水浴法的木瓜多糖平均提取量（50.33±2.06 mg/g） 高出約10.5%。李容等人[26]研究木瓜多糖的提取及醇沉工藝中，木瓜多糖的提取率僅有50 mg/g（5%），對比可知微波法輔助提取有更好的提取率。

表3 回歸模型方差分析

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除率測定

通過抗氧化性物質與DPPH·單電子的配對，使其醇溶液顏色變化，于波長517 nm處的吸收消失，評價清除物質的清除能力。

木瓜多糖對DPPH·的清除作用見圖7。

由圖7可知，木瓜多糖對DPPH·的清除作用結果顯示，隨著反應體系中木瓜多糖溶液質量濃度的提高，清除率逐漸升高，木瓜多糖清除DPPH·自由基的能力增強，清除效力與質量濃度有良好的量效關系，而且其關系以二次多項式擬合最好，清除率與木瓜多糖質量濃度的關系：

Y=0.857 1X2+6.177 1X-3.82，R2=0.996 4（Y為清除率，%；X為木瓜多糖質量濃度，mg/mL）。

由于高質量濃度的木瓜多糖含有的抗氧化功能集團（羥基、酚羥基）多于低質量濃度的木瓜多糖，這些羥基、酚羥基是抗氧化的主要功能團，針對清除DPPH·活性的動力學反應性質，馮學珍等人[27]利用網地藻多糖展開了研究，通過3種濃度的二級反應常數對比發現，隨著多糖反應濃度逐漸升高，其清除DPPH·的速度越來越快，清除自由基能力也越來越強，因此試驗中木瓜多糖質量濃度越高，則DPPH·的清除能力越強。

試驗結果表明，上述提取法能夠有效地保持木瓜多糖的抗氧化活性。

2.4.2·OH清除率測定

據現代研究表明，·OH是機體內毒性最強的活性氧自由基，其壽命短、反應性強，是導致生物有機體過氧化損傷的主要原因。·OH可以引起組織病變，從而導致疾病發生、加速生物機體衰老。若通過攝入適量外源性清除食物，可有效預防這些情況的發生。利用Fenton反應可以有效檢測多糖清除自由基的能力，H2O2和Fe2+混合時，生成高活性的·OH，水楊酸結合生成有色物質。向該反應體系中加入有清除作用的物質時，優先結合·OH，使水楊酸結合的自由基數量減少，從而減少有色物質，于510 nm波長下測定吸光度確定·OH剩余含量即可判斷清除能力。

試驗中所提取木瓜多糖中含有豐富的生物多糖，其與水楊酸形成清除·OH的競爭反應。

木瓜多糖對·OH的清除作用見圖8。

由圖8可知，當木瓜多糖質量濃度為1.2 mg/mL時，·OH清除率為2.9%，隨木瓜多糖質量濃度增加，當達到2.8 mg/mL時，清除能力高達47.9%左右，木瓜多糖（APS）對·OH的清除能力呈現良好的量效關系，清除率與多糖質量濃度的關系Y=0.857 1X2+6.177 1X-3.82，R2=0.989 8（Y為清除率，%；X為木瓜多糖質量濃度，mg/mL），呈二次函數遞增趨勢，說明在一定范圍內，木瓜多糖具有較強的清除·OH能力，同時表明該方法提取的木瓜多糖能夠保持很好的抗氧化活性。

3 結論

采用響應面法優化了木瓜多糖的提取工藝，利用微波輔助提取法從木瓜濾渣中提取木瓜多糖構建了提取的回歸模型，獲得優化后的提取條件為料液比1∶40，微波時間30 s，水浴溫度90℃，水浴時間60 min。以提取過綠原酸的光皮木瓜濾渣為原料，3次重復驗證試驗微波輔助提取木瓜多糖的平均提取率可達60.83±2.09 mg/g。比相同條件下傳統水浴法的木瓜多糖平均提取率（50.33±2.06 mg/g） 高出約10.5%，優于前人的研究成果。由此可知，微波輔助提取具有更優的提取效果。

分別利用DPPH·，·OH 2種方法對提取的光皮木瓜多糖進行了抗氧化試驗，經過結果對比分析，發現該方法提取的木瓜多糖對DPPH·和·OH均具有良好的清除能力，抗氧化性與溶液質量濃度有顯著的量效關系，隨質量濃度增大而增大，這表明該方法提取的木瓜多糖能夠保持較好的抗氧化活性，為木瓜的產業化綜合利用提供理論依據。

同時，由于機體自由基中危害極大的·OH，可引起細胞的死亡、機體衰老等危害，亟待開發有抗氧化和清除·OH作用的天然物質。木瓜多糖作為一種取自木瓜的天然抗氧化性物質，既無毒害，又無劑量限制，未來研究中可以作為·OH的強清除劑，同時，木瓜中豐富的功能活性成分在功能性食品方面顯有著廣闊的開發前景。