超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中利巴韋林殘留量

文/王紫竹 周 鑫 鄒唯嘉

（天津市乳品食品監(jiān)測中心）

利巴韋林又稱病毒唑，為核苷類似物，獸醫(yī)臨床上常用于腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等感染性疾病的防治，可用于奶牛傳染性鼻氣管炎、牛惡性卡他熱、牛潰瘍性乳頭炎、牛副流感等疾病的治療及預(yù)防。因其毒性及藥物濫用存在影響人類健康和生態(tài)平衡的潛在危害，2005年原農(nóng)業(yè)部第560號公告廢止了利巴韋林及其鹽、酯以及單復(fù)方制劑的獸藥用途，禁止銷售及在畜禽養(yǎng)殖過程中使用利巴韋林制劑或原料藥，在動物性食品中不得檢出。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配ESI源，LC30A-8050A）；電子分析天平（0.001 g）；高速冷凍離心機(jī)；超聲波儀；恒溫水浴鍋；渦旋振蕩器；pH計；氮吹儀；固相萃取裝置；PBA固相萃取柱（Cleanert PBA，100 mg，3 mL）。

1.2 藥品和試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息見表1。酸性磷酸酯酶（活力≥0.4 unit/mg），三氯乙酸，氨水，均為分析純；乙酸銨，乙腈，甲醇，甲酸，均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得到約1 mg/mL的儲備液。用移液管準(zhǔn)確移取上述儲備液100 μL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻后得到濃度約為1 μg/mL的工作液。

準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)利巴韋林-13C5約10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得到約1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。用移液管準(zhǔn)確移取上述內(nèi)標(biāo)儲備液100 μL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻后得到濃度約為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)儲備液與內(nèi)標(biāo)儲備液置于-18 ℃條件下保存，有效期6個月，標(biāo)準(zhǔn)工作液與內(nèi)標(biāo)工作液置于0～5 ℃條件下保存，有效期為2 周。

表2 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 三氯乙酸溶液

稱取20 g三氯乙酸，加入約950 mL水使其溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH值至4.8±0.1，再用水定容至1 L，得到濃度為20 g/L的三氯乙酸溶液。

1.3.3 酸性磷酸酯酶溶液

準(zhǔn)確稱取酸性磷酸酯酶10 mg，置于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻后得到100 μg/mL的酸性磷酸酯酶解液，置于0～5 ℃條件下保存。

1.3.4 乙酸銨緩沖溶液

稱取18.12 g乙酸銨固體，加入約950 mL水使其溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH值至8.5±0.1，再用水定容至1 L，得到濃度為0.25 mol/L的乙酸銨緩沖溶液。

1.3.5 甲酸水溶液

用移液槍吸取2 mL甲酸，加入500 mL水中，得到濃度約為100 mmol/L甲酸水溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品前處理

（1）提取

稱取5 g（精確至0.01 g）牛奶樣品，置于50 mL離心管中，用移液槍加入100 μL內(nèi)標(biāo)工作液（濃度為1 μg/mL），渦旋混合30 s，加入10 mL三氯乙酸溶液和3 mL乙腈，渦旋混勻2 min，在超聲波儀中超聲5 min，于4 ℃條件下10 000 r/min下離心5 min，取上清液于25 mL容量瓶中，再加入5 mL三氯乙酸溶液重復(fù)提取一次，離心后合并上清液至容量瓶中，用三氯乙酸溶液定容至25 mL。

（2）酶解

用移液管準(zhǔn)確移取5 mL提取液，加入1 mL乙酸銨溶液，渦旋混勻30 s，再加入100 μL酸性磷酸酯酶溶液，加蓋后渦旋1 min，于37 ℃恒溫水浴中培養(yǎng)2 h。取出后冷卻至室溫。用氨水調(diào)pH值至8.5±0.1，于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

（3）凈化

用3 mL乙腈、1 mL甲酸水溶液和3 mL乙酸銨緩沖溶液依次活化固相萃取柱；用移液管準(zhǔn)確移取（1）中提取的上清液5 mL上樣，自然流速過柱，待上清液流過固相萃取柱后，依次用3 mL乙酸銨緩沖溶液和3 mL水淋洗，真空抽干5 min；用2 mL甲酸水溶液洗脫至氮吹杯中，40 ℃條件下用氮?dú)獯蹈桑挥? mL乙腈溶解殘渣，0.22 μmPTFE濾膜過濾至樣品瓶中，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4.2 儀器條件

（1）色譜條件

色譜柱為BEH HILIC柱（1.7μm，2.1 mm×100 mm）；色譜柱柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為2 μL；流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸），流動相B為乙腈，流速為0.35 mL/min。梯度洗脫條件見表2。（2）質(zhì)譜條件

離子源及電離方式為電噴霧離子源（ESI），正離子檢測模式；霧化氣為氮?dú)猓髁?.0 L/min；干燥氣為空氣，流量為10 L/min；加熱氣為空氣，流量為10 L/min；碰撞氣為氬氣，壓力為270 KPa；接口溫度為300 ℃；脫溶劑管溫度為250 ℃；加熱塊溫度為400 ℃。其它條件見表3。

表3 利巴韋林及內(nèi)標(biāo)物的定性、定量離子對及其它質(zhì)譜條件

表4 相對離子豐度的允許偏差

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定液的配制

用移液管分別移取0.01、0.05、0.20、0.50、0.80、1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液于6 個10 mL容量瓶中，再向6 個容量瓶中分別加入0.2 mL內(nèi)標(biāo)工作液，用乙腈稀釋至刻度，配制6 個標(biāo)準(zhǔn)曲線測定液，濃度分別為1.00、5.00、20.00、50.00、80.00、100.00 ng/mL。

1.4.4 定性分析

在上述相同的試驗(yàn)條件下，樣品中待測物質(zhì)與對應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)，且樣品色譜圖中待測物質(zhì)的定性離子相對離子豐度相對于相近濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)符合表4要求，則可判定該樣品中存在利巴韋林。

1.4.5 樣品添加回收率和精密度測定

（1）空白樣品

選取牛奶樣品，按照前處理方法及步驟進(jìn)行試驗(yàn)，以確定本底中利巴韋林的含量低于檢出限，可作為空白試樣進(jìn)行樣品添加回收率的測定。

（2）準(zhǔn)確度和精密度

利巴韋林檢驗(yàn)確定加標(biāo)水平為①1.00 μg/kg和②10.00 μg/kg，其中①為測定低限、②為線性范圍內(nèi)高濃度水平10 倍測定低限。根據(jù)前處理步驟中稱樣量、稀釋及定容步驟換算樣液濃度分別為①1.00 ng/mL和②10.0 ng/mL，利巴韋林實(shí)際樣液濃度分別為①0.96 ng/mL和②9.60 ng/mL。

1.4.6 靈敏度測定

取利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，添加到空白牛奶樣品中，使牛奶中利巴韋林含量分別為0.20、0.50和1.00 μg/kg，按前處理步驟進(jìn)行試驗(yàn)后，測定利巴韋林定量離子對的信噪比（S/N）及相應(yīng)添加濃度，以S/N≥3時的添加濃度為方法檢出限。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 色譜圖

空白牛奶樣品和牛奶添加樣品中利巴韋林和利巴韋林-13C5的定性及定量離子對色譜圖見圖1-a和1-b所示，牛奶添加樣品中利巴韋林和內(nèi)標(biāo)物峰型良好，與雜質(zhì)峰分離度較好，基質(zhì)干擾小。

2.2 線性關(guān)系及范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1.00～100.00 ng/mL，以內(nèi)外標(biāo)濃度比值作為橫坐標(biāo)，內(nèi)外標(biāo)響應(yīng)峰面積比值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及r2。如圖2所示，r2為0.9971，線性關(guān)系良好。

2.3 方法回收率及精密度

空白牛奶添加利巴韋林的回收率及精密度測定結(jié)果見表4。在①和②的添加水平上，利巴韋林的回收率范圍在82.6%～115%，變異系數(shù)分別為3.45%和1.72%，結(jié)果符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404-2008）附錄F中關(guān)于檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求的規(guī)定。

2.4 檢出限

圖1 -a 空白牛奶樣品中利巴韋林和利巴韋林-13C5色譜圖

圖1 -b 添加濃度為10 μg/kg牛奶樣品中利巴韋林和利巴韋林-13C5色譜圖

圖2 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

本方法試驗(yàn)條件下，當(dāng)空白牛奶樣品中利巴韋林的濃度為0.50 μg/kg時，其色譜峰信噪比S/N≥3，此濃度即為檢出限。

3 結(jié)論及討論

3.1 試驗(yàn)采用酶解方法將利巴韋林代謝物酶解成利巴韋林原藥形式，再用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行儀器分析，從而可以準(zhǔn)確測定利巴韋林的殘留總量。PBA固相萃取柱對牛奶基質(zhì)中存在的雜質(zhì)去除效果較強(qiáng)，利巴韋林檢測靈敏度較高。

3.2 利巴韋林的極性較大，在一般常用的反相C18色譜柱上保留作用不強(qiáng)，峰型較差，換為HILIC柱后，利巴韋林有了較好的保留，峰型有了極大改善。

3.3 牛奶中基質(zhì)較復(fù)雜，采用液質(zhì)方法進(jìn)行測定時基質(zhì)干擾較大，僅用外標(biāo)法定量結(jié)果準(zhǔn)確度較低，采用利巴韋林同位素作為內(nèi)標(biāo)加入試驗(yàn)過程，用內(nèi)標(biāo)法定量，可以很大程度消除牛奶基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高了方法定量準(zhǔn)確度。

3.4 通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，本實(shí)試驗(yàn)法有較好的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足對牛奶中利巴韋林殘留分析的要求。C

表5 利巴韋林不同濃度水平加標(biāo)回收率及精密度

平行樣編號實(shí)測樣液濃度（ng/mL） 1.091 1.079 1.103 1.003 1.077 1.030 1.064 3.45添加水平 1 2 3 4 5 6 平均值 變異系數(shù)（%）①樣品濃度1.00 μg/kg（樣液濃度0.96 ng/mL） 回收率（%） 114 112 115 104 112 107 111實(shí)測樣液濃度（ng/mL） 8.284 8.132 7.952 8.204 8.145 7.931 54.208 1.72②樣品濃度10.00 μg/kg（樣液濃度9.60 ng/mL）回收率（%） 86.3 84.7 82.8 85.5 84.8 82.6 84.5

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