Fe2+和EDTA對厭氧氨氧化工藝快速啟動及菌群特性的影響

唐政坤，李軍，張碩，李光蕾，李行

（沈陽建筑大學市政與環境工程學院，沈陽 110168）

引言

厭氧氨氧化菌是一種自養菌，其生長緩慢，世代時間長達11d，生長速率非常慢，只有在高達1010個/mL以上的細胞密度時，才能顯現出厭氧氨氧化活性[1]。對于快速實現厭氧氨氧化菌的富集和厭氧氨氧化反應器的啟動，國內外大多數研究是通過接種硝化污泥、厭氧污泥或厭氧氨氧化顆粒污泥較快地實現了Anammox的啟動，這些研究的缺點是都需要運用到成熟的厭氧菌，而本研究認為快速啟動Anammox的關鍵仍舊在于對環境條件的調控，如果能通過普通活性污泥快速啟動此工藝，將減少工藝啟動成本，使得Anammox工藝在實際工程應用中具有普適性。

在查閱大量文獻后，發現Fe2+很有可能成為厭氧氨氧化反應器啟動過程中的缺乏關鍵元素，其中Van Niftrik等[2]研究表明，厭氧氨氧化體單元內含有豐富的 Fe元素，并且厭氧氨氧化體內還含有大量血紅素[3]，Fe2+也正是血紅素的重要組成物質，同時毛念佳[4]等人直接證明鐵離子對厭氧氨氧化菌的富集有促進作用，彭廈[5]在研究金屬離子對厭氧氨氧化效能影響時發現，鐵離子都可以促進反應器脫氮效率的提高，并且可以刺激Anammox菌的生長并判斷亞鐵離子很有可能在厭氧氨氧化菌代謝過程中起到了電子供體的作用。然而有實驗證明Fe2+隨著廢水進入反應器中，易與反應器中的磷、鈣離子共同作用形成不溶物，不易被厭氧氨氧化菌所吸收利用。另有實驗[6]證明Fe（Ⅱ）EDTA能夠與NO在水中形成絡合物，增加了NO的溶解度，可促進厭氧氨氧化還原NO生成N2。

本文以普通活性污泥為培養對象，利用EDTA與Fe2+形成穩定的螯合物，研究Fe2+和EDTA的添加以及它們的濃度變化對厭氧氨氧化工藝啟動快慢的影響，并且在生物特性方面加以鑒定，為快速啟動厭氧氨氧化工藝做出理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

實驗裝置采用UASB（上流式厭氧污泥床）反應器（如圖1）。UASB反應器總有效體積8.3L、沉淀區有效體積為5.2L、反應區體積為3.1L，活性污泥接種于反應區內。反應區內徑7cm，外設2cm厚的套管實現水浴循環，保證反應區微生物所需溫度。進水流速通過蠕動泵來調控。裝置的運行條件：溫度為30℃～35℃，進水pH值為6.8～7.2。

圖1 工藝流程及試驗裝置圖

1.2 實驗用水與接種污泥

活性污泥取自遼寧撫順三寶屯污水處理廠的二沉池回流污泥，MLSS為7865mg/L。實驗進水模擬生活污水中的主要成分，主要以NH4Cl和NaNO2組成，以NaCO3為碳源，另外添加MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、KH2PO4和微量元素。表1和表2是具體成分濃度。

表1 厭氧氨氧化反應器配水成分

表2 厭氧氨氧化反應器配水微量元素成分

1.3 常規分析項目與檢測方法

常規分析項目見表3。顆粒污泥粒徑采用濕式篩分法[7]，采用的篩子孔徑為0.5、0.9、1.5、2、3mm。

表3 常規分析項目與方法

1.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析[8]

1.4.1 DNA提取

取2個污泥顆粒樣品，樣品編號為：1、2；跑膠順序為：1、1、1、2、2、2。采用FastDNATMSPIN Kit For Soil提取樣品基因組DNA，以樣品基因組DNA為模板，采用厭氧氨氧化細菌引物[12]Pla46rc和Amx820擴增樣品16SrRNA高變區序列見表4。

表4 引物信息

1.4.2 PCR擴增

PCR擴增體系（50μL）組成為：10×PCR buffer5μL；dNTP（2.5mM）3.2μL；rTaq（5U/μL）0.4μL；Pla46rc（20μM）1μL；Amx820（20μM）1μL；模板DNA 50ng；補ddH2O至50μL。PCR擴增條件為：94℃、5min；94℃、30s；56℃、45s；72℃、1min、33個循環；72℃、5min。PCR產物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.4.3 DGGE分析

取10μLPCR的產物進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。電泳條件為：變性梯度10%～30%、濃度8%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為1×TAE，電壓100V、溫度60℃、電泳17小時。變性梯度凝膠電泳（DGGE）完畢后、采用銀染法[9]染色，最后完成DGGE圖譜中優勢條帶的回收與測序。

1.4.4 實驗方法

表5所示為厭氧氨氧化啟動階段的進水調控策略，先以與生活污水指標接近的低氨氮濃度進行啟動。通過逐步提高進水基質濃度和縮短HRT兩種方式，提升負荷，加快AAOB的聚集，同時淘洗出其余菌群；為探究Fe2+、EDTA對厭氧氨氧化啟動的影響，實驗中，在第42天將Fe2+和EDTA濃度分別由0.018mmol/L及0.017mol/L 提升至0.05mmol/L及0.034mol/L，最后進行菌種鑒定。

表5 厭氧氨氧化反應器運行操作條件變化

2 結果與分析

2.1 厭氧氨氧化污泥特性變化

實驗分兩個階段：不提升Fe2+和EDTA的濃度（0～42d）；提升Fe2+和EDTA的濃度（42d以后）。控制進水NH4+-N和NO2--N負荷在0.05kg/m3·d左右，如圖2，開始啟動反應器的前4d，出現出水氨氮濃度高于進水的現象，隨著時間的推移，NH4+-N和NO2--N的出水濃度逐漸降低。如圖3，前14d，NH4+-N去除率維持在6%～10%，在14～42d內一直維持在45%左右；NO2--N去除率呈逐步上升趨勢，在反應器啟動的前9d，去除率就增至80%左右。分析認為，從污水處理廠取回的污泥在曝氣一天預處理后接種于反應器內，突然的缺氧環境對微生物的活性產生了一定的抑制，尤其是一些自養菌沒有了有機碳源后，無法適應環境而死亡解體發生氨化現象，釋放出了儲存在內部的氨氮，使得初期出水氨氮含量略高于進水。啟動初期的污泥中含有較為豐富的種群，如硝化細菌、反硝化細菌等，而污泥中殘余的有機物正好被反硝化菌利用，并以亞硝態氮為電子受體，發生了發硝化作用，才導致前期亞硝態氮出水濃度一直較低，這些現象與路青等[10]的研究結果一致。圖2和圖5顯示反應器的NH4+-N與NO2--N濃度在啟動初期維持較低，相應的TN容積負荷也較低。容積負荷在這個階段主要維持在0.1～0.12kg/m3·d。在前40d，反應器中的AAOB還沒有很好地集聚，整體菌群的活性也較低。因此在較低的容積負荷下，去除負荷也不高，TN維持在0.02～0.03kg/ m3·d，最高也僅達到0.044kg/m3·d，這與圖3中較低的去除率相對應。進一步說明初期階段是微生物對環境的適應期。從14～41d內，NH4+-N和NO2--N去除率在18%～30%之間變化，并且呈現出兩者被同時去除的趨勢。可以看出，該階段AAOB正在適應外部環境，沒有很好地富集，不是優勢菌種。由于前期實驗沒有對進水箱和反應器進行消氧處理，一定程度上抑制了AAOB的生長活性。

第42d開始用氮氣對反應器和進水箱進行消氧處理，滿足AAOB所需的絕對厭氧環境。同時，為進一步加快啟動過程，提高配水微量元素溶液中Fe2+和EDTA的螯合劑濃度。在實驗中，將Fe2+和EDTA濃度分別由0.018mmol/L與0.017mol/L提升至0.05mmol/L與0.034mol/L。由于生物在生長過程中需要的很多蛋白本身含有鐵元素，因此可以說鐵元素是生物生長代謝中的重要物質[11]。對于厭氧氨氧化菌體內富含血紅素[12]，并且成熟的AAOB顆粒污泥呈現出的鮮紅色，這些足可以判斷，足夠的鐵元素可以加強AAOB的生長，提高Fe2+濃度會加強AAOB的代謝能力。在自然界鐵多以氧化物形態存在，經常成為微生物生長代謝的限制因子[13]。在低溫厭氧產甲烷的研究中，發現金屬離子螯合劑與Ni等微量元素能形成穩定的螯合物[14]，從根本上提升了金屬元素的溶解度，微生物對于微量元素的利用率也得到提高，由于微量營養元素中的EDTA本身就是良好的金屬離子螯合劑，EDTA與Fe2+的螯合作用能夠提高Fe2+的溶解性，使得微生物對亞鐵離子的利用率提高。

從圖3和圖5可看出，在采用了多種措施后的第46d開始，反應器效能提升明顯，到第57d時，NH4+-N去除率從26%提升至93%左右；NO2--N去除率從26%提升至了98%左右，TN去除負荷從0.03kg/m3·d到0.11kg/m3·d，是未提升Fe2+和EDTA濃度時的3倍。考慮到此階段TN容積負荷（0.13～0.15kg/m3·d）。可以認為進水基質中的NH4+-N和NO2--N幾乎被完全去除。隨著菌種對環境的適應以及對環境條件的優化，AAOB活性有了明顯提升，反應器效能提升明顯。兩種主要代謝產物同時被AAOB高效去除，厭氧氨氧化效果明顯，這是Anammox啟動成功的一個重要標志。從圖4的進出水pH值變化角度也能體現出這一點。厭氧氨氧化在反應過程中會消耗氫離子，即表明此反應實際上是產堿反應[15]，出水pH值略高于進水也是Anammox啟動成功的另一個重要標志，隨著馴化的進行，出水pH值與進水pH值變化曲線的“分離”現象愈發明顯。在活性增強階段，出水pH值從7.6提升至8.2左右，Anammox最佳生長pH值為6.7～8.3[16]，而本實驗pH值7.8～8.4的偏弱堿性環境正是AAOB生長最適宜的范圍。綜上所述，反應器啟動成功。

圖2 厭氧氨氧化啟動階段氨氮、亞硝態氮濃度變化

圖3 厭氧氨氧化啟動階段氨氮與亞硝態氮去除效能變化

圖4 厭氧氨氧化啟動階段進出水pH變化

圖5 厭氧氨氧化啟動階段負荷變化

2.2 菌種生物鑒定

為進一步探究Anammox反應器中的生物特性，以Anammox反應器中顆粒污泥作為樣本，在反應器污泥底部和頂部同時取樣，并分別編號為：1、2；跑膠順序為：1、1、1、2、2、2。采用PCR-DGGE技術[17]對反應體系進行菌種鑒定。

2.2.1 DNA提取結果

采用FastDNATMSPIN Kit For Soil提取樣品基因組DNA，以Pla46rc/Amx820為引物擴增16SrRNA序列，得到目的DNA片段（如圖6）用于DGGE分析。

圖6 DNA提取圖

2.2.2 PCR產物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）

樣品16SrRNA PCR產物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析結果如圖7。

圖7 GC-PCR圖

圖8 電泳圖和量化分析膠圖

表6 戴斯系數比較PCR-DGGE圖譜的相似性（%）

表7 序列比對分析結果

從圖8的電泳圖（a）和量化分析膠圖（c）中可以看出，分別取自反應器頂部的樣品1和底部的樣品2，一共出現了10個條帶。其中從電泳圖（a）可明顯看出，在樣品1和2中，條帶9最為明顯清晰，應該是此反應系統中的主要菌群，因此作為主要電泳條帶進行回收分析。另外，從量化分析圖中可明顯觀察到，樣本1中的9號條帶更大也更為清晰；而樣本2中出現的條帶數更多，說明反應器中的主要菌群即AAOB主要集中在底部，優勢菌種占據的生態位明顯，而頂部的菌群多樣性稍好一些。表6顯示著PCR-DGGE圖譜具體相關性。主要菌種，說明Anammox菌在逐漸發生著演變，并且最終確定Anammox系統中的菌種為（浮霉菌門）Candidatus Jettenia caeni。該菌種屬于Anammox菌群中的Candidatus Jettenia屬，被歸入浮霉狀菌科（Planctomycetes）。該屬的Anammox菌是以荷蘭微生物學家Mike S. M. Jetten命名的。Candidatus Scalindua多存在于海洋[19、20]。從收錄的AnAoB的系統發育樹可知，污泥樣品中Anammox菌的Brocadia菌屬逐漸成為為優勢菌屬 同時也有anammoxidans菌屬和少量的Anammoxoglobus菌屬。本實驗菌種鑒定所得出的Anammox菌種類較少，主要菌種只有1種，整個反應體系的特異性較強。一方面可以說明，前期的馴化策略有效保證了Anammox菌群的優勢地位，不適應系統環境的菌屬被淘汰。Kartal[21]等研究表明, 這種細菌能在顆粒團聚體中檢測到，不適宜在絮體污泥中生長，并且以往的研究結果[22]表明，在一種特定生境中， Anammox菌多樣性較弱，一般占據優勢的菌種為單一種屬；另一方面，很多研究者初期馴化中都加入了COD，使得反應體系中的異養菌群得以生長，最終得出的微生物種類也就更多。收錄的5屬8種AnAOB的系統發育關系[18]見圖9。

2.2.3 主要電泳條帶的序列測定

DGGE凝膠條帶回收后，以Pla46rc/Amx820為引物進行PCR擴增，獲得目的DNA片段。PCR產物純化后連接到pMD18-T載體上，轉化至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆測序。

將測序結果與GenBank中的序列進行比對，得到條帶所代表的細菌類型。每個回收條帶選取3個克隆進行了序列測定，如表7。

從表7可知，在厭氧氨氧化工藝成功啟動后，污泥顆粒經過PCR-DGGE實驗，相似度99%的菌株為反應器中的

3 結論

（1）在實驗第42d，將Fe2+和EDTA濃度分別由0.018mmol/L與0.017mol/L提升至0.05mmol/L與0.034mol/L，配合氮氣消氧等措施，經過15d就成功啟動了Anammox，脫氮效能高效穩定，NH4+-N與NO2--N去除率穩定在90%以上。

（2）PCR-DGGE技術對系統中的Anammox菌進行了菌種鑒定，最終表明反應器中的AAOB菌為Candidatus Jettenia caeni。該菌種屬于Anammox菌群中的Candidatus Jettenia屬，被歸入浮霉狀菌科（Planctomycetes）。